Microscopio electrónico de varrido

Non confundir con Microscopio electrónico de transmisión de varrido (METV ou STEM).

Imaxe de grans de pole tomada con MEV que mostra a característica profundidade de campo e tridimensionalidade das micrografías de MEV.

Primeiro MEV de M. von Ardenne

Principio operativo do MEV.

MEV coa cámara de mostras aberta

MEV de tipo analóxico.

Un microscopio electrónico de varrido (MEV ou, en inglés, SEM, de scanning electron microscope) é un tipo de microscopio electrónico que produce imaxes dunha mostra varrendo (escaneando) a súa superficie cun feixe de electróns enfocado. Os electróns interacionan cos átomos da mostra, producindo varios sinais que conteñen información sobre a topografía da superficie e composición da mostra. O feixe de electróns escanea nun modo raster (trama de mapa de bits) e a posición do feixe está combinada coa intensidade do sinal detectado para producir unha imaxe. No modo de MEV máis común, os electróns secundarios emitidos por átomos excitados polo feixe de electróns detéctanse usando un detector de electróns secundarios (detector Everhart–Thornley). O número de electróns secundarios que se pode detectar e así a intensidade do sinal, depende, entre outras cousas, da topografía do espécime observado. Algúns MEVs poden acadar resolucións de menos dun nanómetro.

Os espécimes obsérvanse en alto baleiro no MEV convencional, ou en baixo baleiro ou condicións húmidas no MEV ambiental ou de presión variable, e nun amplo rango de temperaturas crioxénicas ou elevadas con instrumentos especializados.

Historia

Segundo a exposición da historia da microscopia electrónica de varrido presentada por McMullan, esta empezou así: Aínda que Max Knoll sacou unha foto cunha anchura de campo-obxecto de 50 mm mostrando contraste canalizado co uso dun escáner de feixe de electróns, foi Manfred von Ardenne quen en 1937 inventou un microscopio cunha alta resolución ao escanear un raster moi pequeno cun feixe de electróns finamente enfocado e desmagnificado. Ardenne aplicou o escáner de feixe de electróns para intentar superar a resolución do microscopio electrónico de transmisión (MET), e tamén para mitigar os problemas coa aberración cromática inherentes á obtención de imaxes reais no MET. Despois examinou os varios modos de detección, posibilidades e teoría do MEV, xunto coa construción do primeiro MEV de alta resolución. Traballos posteriores foron os presentados polo grupo de Zworykin, seguido polos grupos de Cambridge na década de 1950 e principio da de 1960 liderados por Charles Oatley, todos os cales finalmente levaron á comercialización do primeiro instrumento comercial pola Cambridge Scientific Instrument Company co nome "Stereoscan" en 1965, que foi entregado a DuPont.

Principios e capacidades

Fonte de electróns de emisor Schottky.

Volume de interacción electrón–materia e tipos de sinais xerados.

Os sinais utilizados polo MEV para producir unha imaxe orixínanse polas interaccións do feixe de electróns con átomos a varias profundidades na mostra. Prodúcense varios tipos de sinais, como electróns secundarios, electróns reflectidos ou retrodispersados (BSE en inglés), raios X característicos e luz (catodoluminescencia), corrente absorbida (corrente de espécime) e electróns transmitidos. Os detectores de electróns secundarios son un equipamento estándar en todos os MEVs, pero poden non ter todos os outros detectores.

Os electróns secundarios teñen enerxías moi baixas da orde de 50 eV, que limitan o seu camiño libre medio na materia sólida. En consecuencia, os electróns secundarios só poden escapar desde a parte superior a poucos nanómetros da superficie da mostra. O sinal dos electróns secundarios adoita estar altamente localizado no punto de impacto do feixe de electróns primario, o que fai posible recoller as imaxes da superficie da mostra cunha resolución por debaixo dun nm. Os electróns retrodispersados son electróns do feixe que son reflectidos pola mostra por dispersión elástica. Como teñen moita maior enerxía que os electróns secundarios, emerxen de localizacións máis profundas do espécime e, en consecuencia, a resolución das imaxes de electróns retrodispersados é menor que a das imaxes de electróns secundarios. Porén, os electróns retrodispersados utilízanse a miúdo nos MEVs analíticos, xunto co espectro feito a partir dos raios X característicos, porque a intensidade do sinal dos electróns retrodispersados está moi relacionada co número atómico (Z) do espécime. As imaxes de electróns retrodispersados poden proporcionar información sobre a distribución, pero non a identidade, de diferentes elementos nunha mostra. En mostras compostas predominantemente de elementos lixeeiros, como os espécimes biolóxicos, os electrons retrodispersados poden obter imaxes de inmunoetiquetados de ouro coloidal de 5 ou 10 nm de diámetro, que doutro modo serían difíciles ou imposibles de detectar en imaxes de electróns secundarios. Os raios X característicos emítense cando o feixe de electróns retira un electrón da capa interna dunha mostra, causando que un electrón de alta enerxía encha a capa e libere enerxía. A enerxía ou lonxitude de onda destes raios X característicos pode medirse por espectroscopia de raios X por dispersión de enerxía ou espectroscopia de raios X por dispersión de lonxitude de onda e usada para identificar e medir a abundancia de elementos na mostra e mapar a súa distribución.

Debido a que o feixe de electróns é moi estreito, as micrografías de MEV teñen unha gran profundidade de campo rendendo unha aparencia tridimensional útil para comprender a estrutura da superficie da mostra. Isto exemplifícase coa micrografía do pole que se mostra arriba. É posible un amplo rango de aumentos, desde 10× (equivalente aproximadamente á potencia dunha lupa de man) a máis de 500.000×, o que é unhas 250 veces o límite de aumento do mellor microscopio óptico.

Preparación da mostra

Unha araña pulverizada cuberta de ouro, preparada para vela nun MEV.

Micrografía de baixa voltaxe (300 V) da distribución de pingas adhesivas sobre unha nota post-it. Non se aplicou cobertura condutora: dita cobertura alteraría este fráxil espécime.

As mostras para MEV teñen que ser suficientemente pequenas para que se axusten á platina do espécime, e poden necesitar unha preparación especial para incrementar a súa condutividade eléctrica e estabilizalas, para que poidan soportar as condicións de alto baleiro e o feixe de alta enerxía dos electróns. As mostras xeralmente están montadas rixidamente sobre un soporte de espécime ou chatola (stub) usando un adhesivo condutor. O MEV úsase amplamente para analizar defectos de obleas ou wafers semicondutoras, e os fabricantes crearon instrumentos que poden examinar cada parte dunha oblea semicondutora de 300 mm. Moitos instrumentos teñen cámaras que poden inclinar un obxecto dese tamaño 45° e proporcionar unha rotación continua de 360°.^{[Cómpre referencia]}

Os espécimes non condutores recollen a carga cando os escanea un feixe de electróns e, especialmente no modo de imaxe de electróns secundarios, isto causa fallos ao escanear e outros artefactos de imaxe. Para a obtención de imaxes convencionais nos MEVs, os espécimes deben ser condutores eléctricos, polo menos na superficie, e ter toma de terra para previr a acumulación de cargas electrostáticas. Os obxectos de metal necesitan pouca preparación especial para MEV excepto limpalos e montalos condutoramente nunha chatola (stub) de espécime. Os materiais non condutores son xeralmente cubertos cunha capa ultrafina de material electricamente condutor, depositado na mostra por cobertura por pulverización a baixo baleiro ou por evaporación a alto baleiro. Os materiais condutores en uso actualmente para cubrir os espécimes son o ouro, aliaxe ouro/paladio, platino, iridio, volframio, cromo, osmio, e grafito. A cobertura con metais pesados pode incrementar a razón sinal/ruído para mostras de baixo número atómico (Z).

Unha alternativa ao recubrimento dalgunhas mostras biolóxicas é incrementar a condutividade da masa do material por impregnación con osmio usando variantes do método de tinguidura OTO (O-tetróxido de osmio, T-tiocarbohidrazida, O-osmio).

Poden obterse imaxes de espécimes non condutores sen recubrilos usando MEV ambiental ou o modo de funcionamento de baixa voltaxe do MEV. Nos instrumentos de MEV ambiental o espécime sitúase nunha cámara de presión relativamente alta e a columna óptica de electróns é bombeada diferencialmente para manter adecuadamente baixo o baleiro no canón de electróns. A rexión de alta presión arredor da mostra no MEV ambiental neutraliza a carga e proporciona unha amplificación do sinal dos electróns secundarios.^{[Cómpre referencia]} Os escaneos a baixa voltaxe realízanse nun instrumento cun canón de emisión de campo que pode producir unha alta brillantez de electróns primarios e pequenos tamaños de punto (spot size, o diámetro da zona onde o feixe incide sobre a mostra) incluso a potenciais de baixa aceleración. Para impedir a carga eléctrica de espécimes non condutores, as condicións de funcionamento deben axustarse de xeito que a corrente de feixe entrante sexa igual á suma das correntes de saída de electróns secundarios e retrodispersados, unha condición que adoita conseguirse a voltaxes de aceleración de 0,3–4 kV.^{[Cómpre referencia]}

Pode realizarse unha incrustación en resina e posterior puído ata un acabado de espello tanto para espécimes biolóxicos coma para materiais cando se queren obter imaxes de electróns retrodispersados ou cando se fai unha microanálise de raios X cuantitativa.

As principais técnicas de preparación non son necesarias no MEV ambiental esquematizado máis abaixo, mais algúns espécimes biolóxicos poden beneficiarse da fixación.

Mostras biolóxicas

Para a observación de espécimes no MEV, estes normalmente deben estar totalmente secos, xa que a cámara de espécimes está a un alto baleiro. Os materiais duros e secos, como madeira, ósos, plumas, insectos secos ou cunchas e cascas de ovos poden ser examinados con pouco tratamento adicional, pero as células vivas e os tecidos en conxunto, os organismos de corpo mol necesitan unha fixación para preservar e estabilizar as súas estruturas.

A fixación realízase xeralmente por incubación nunha solución dun fixador químico tamponado, como o glutaraldehido, ás veces en combinación con formaldehido e outros fixadores, e seguido opcionalmente da posfixación con tetróxido de osmio. O tecido fixado é despois deshidratado. Como o secado ao aire causa colapso e enrugamento, a deshidratación conséguese comunmente substituíndo a auga das células por solventes orgánicos como o etanol ou a acetona, e a substitución destes solventes á súa vez cun fluído transicional como o dióxido de carbono líquido por secado de punto crítico. O dióxido de carbono retírase finalmente mentres está en estado supercrítico para que non exista ningunha interface gas–líquido na mostra durante o secado.

O espécime seco móntase normalmente nunha chatola (stub) de espécime usando un adhesivo como a resina epoxy ou fita adhesiva de dobre cara que sexa condutora da electricidade, e recuberta por pulverización con ouro ou aliaxe de ouro/paladio antes do exame no microscopio. As mostras poden ser seccionadas (cun micrótomo) se a información sobre a ultraestrutura interna do organismo debe quedar exposta para obter imaxes.

Se o MEV está equipado cunha platina fría para criomicroscopia, pode usarse a criofixación e realizarse a microscopia electrónica de varrido de baixa temperatura nos espécimes fixados crioxenicamente. Os espécimes criofixados poden ser criofracturados no baleiro nun aparello especial para revelar a súa estrutura interna, recubrilos por pulverización e transferidos á crioplatina do MEV mentres están aínda conxelados. A microscopia electrónica de varrido de baixa temperatura tamén é aplicable para obter imaxes de materiais sensibles á temperatura como o xeo e as graxas.

A criofractura, criogravado ou conxelado e rotura é un método de preparación especialmente usado para examinar membranas lipídicas e as súas proteínas incorporadas en vista "frontal". O método de preparación revela as proteínas incrustadas na bicapa lipídica.

Materiais

As imaxes de electróns retrodispersados, análises de raios X cuantitativas e mapado de raios X de espécimes a miúdo requiren desgastar e puír as superficies ata deixar unha superficie ultralisa. Os espécimes que se analizan con espectroscopia de raios X por dispersión de lonxitude de onda ou espectroscopia de raios X por dispersión de enerxía adoitan recubrirse de carbono. En xeral, os metais non se recobren antes de obter as imaxes no MEV porque son condutores e proporcionan o seu propio camiño a terra. A fractografía é o estudo de superficies fracturadas que se pode facer cun microscopio óptico ou, máis comunmente, cun MEV. A superficie fracturada córtase a un tamaño axeitado, límpase de residuos orgánicos e móntase nun soporte de espécime para velo no MEV. Os circuítos integrados poden cortarse cun feixe de ións focalizado (FIB) ou outro instrumento de adelgaamento de feixe de ións para velos no MEV. O MEV no primeiro caso pode ser incorporado no FIB, permitindo facer imaxes de alta resolución do resultado do proceso. Os metais, espécimes xeolóxicos e circuítos integrados poden tamén puírse quimicamente para velos no MEV. Cómpren técnicas de recubrimento de alta resolución especiais para obter imaxes de grande aumento de películas finas inorgánicas.^{[Cómpre referencia]}

Proceso de escaneado e formación de imaxes

Esquema dun MEV.

Nun MEV típico emítese un feixe de electróns termionicamente desde un canón de electróns provisto dun cátodo de filamento de volframio. O volframio utilízase normalmente en canóns termoiónicos porque ten o maior punto de fusión e menor presión de vapor de todos os metais, o que permite que sexa quentado electricamente para a emisión de electróns, e polo seu baixo custo. Outros tipos de emisores de electróns son os cátodos de hexaboruro de lantano (LaB
6), que se poden usar nun MEV de filamento de volframio estándar se o sistema de baleiro é mellorado ou os canóns de enisión de campo, que poden ser de tipo cátodo frío, que usan emisores de monocristal de volframio, ou de tipo Schottky asistidos termicamente, que usan emisores de monocristal de volframio recubertos de óxido de circonio.

O feixe de electróns, que normalmente ten unha enerxía que vai de 0,2 keV a 40 keV, enfócase cunha ou dúas lentes condensadoras a un punto duns 0,4 nm a 5 nm de diámetro. O feixe pasa a través de pares de bobinas de escaneado ou pares de placas deflectoras da columna de electróns, normalmente na lente final, que deflecta o raio nos eixes x e y para que escanee de modo raster sobre unha área rectangular da superficie da mostra.

Mecanismos de emisión de electróns secundarios, electróns retrodispersados e raios X característicos desde átomos da mostra.

Cando o feixe de electróns primario interacciona coa mostra, os electróns perden enerxía por unha repetida dispersión aleatoria e absorción dentro do volume con forma de bágoa do espécime coñecido como volume de interacción, que se estende desde menos de 100 nm a aproximadamente 5 µm da superficie. O tamaño do volume de interacción depende da enerxía de chegada do electrón, o número atómico do espécime e a densidade do espécime. O intercambio de enerxía entre o feixe de electróns e a mostra ten como resultado reflexións de electróns de alta enerxía por dispersión elástica, emisión de elecróns secundarios por dispersión inelástica e a emisión de radiación electromagnética, cada unha das cales pode detectarse por detectores especializados. A corrente de feixe absorbida polo espécime pode tamén detectarse e usarse para crear imaxes da distribución da corrente de espécime. Utilízanse amplificadores electrónicos de varios tipos para amplificar o sinal, que se mostra como variacións na brillantez nun monitor de computador (ou, en modelos antigos, nun tubo de raios catódicos). Cada píxel de memoria de vídeo do computador está sincronizado coa posición do feixe sobre o espécieme no microscopio, e a imaxe resultante é, por tanto, un mapa de distribución da intensidade do sinal que está sendo emitido desde a área escaneada do espécime. Os microscopios vellos captaban as imaxes nunha película, pero os instrumentos modernos recollen imaxes dixitais.

Serie de imaxes a distintos aumentos de MEV de baixa temperatura dun cristal de neve. Os cristais recóllense, almacénanse e son recubertos por pulveriación con platino a temperaturas crioxénicas para obter as imaxes.

Aumentos

Os aumentos nun MEV poden controlarse nunhas 6 ordes de magnitude, desde uns 10 a 3.000.000 de aumentos. A diferenza dos microscopios electrónicos de transmisión e ópticos, a magnificación das imaxes nun MEV non está en función da potencia da lente obxectivo. Os MEVs poden ter lentes condensadoras e obxectivo, pero a súa función é enfocar o feixe sobre un punto, e non obter unha imaxe do espécime. Con tal de que o canón de electróns poida xerar un feixe cun diámetro suficientemente pequeno, o MEV podería en principio funcionar enteiramente sen lentes condensadoras ou obxectivo, aínda que podería non ser moi versátil ou non acadar unha resolución moi alta. Nun MEV, como ocorre na microscopia de sonda de escaneado, a magnificación é o resultado da razón do raster no aparello de visualización e as dimensións do raster sobre o espécime. Asumindo que a pantalla de visualización teña un tamaño fixo, os maiores aumentos orixínanse ao reducir o tamaño do raster sobre o espécime e viceversa. A magnificación é, pois, controlada pola corrente subministrada ás bobinas de escaneado x e y, ou a voltaxe subministrada ás placas deflectoras x e y, e non pola potencia da lente obxectivo.

Deteción de electróns secundarios

O modo de obter imaxes máis común recolle electróns secundarios de baixa enerxía (<50 eV) que son exectados por bandas de valencia ou de condución dos átomos do espécime por interaccións de dispersión inelástica cos electróns do feixe. Debido á súa baixa enerxía, estes electróns orixínanse desde capas a uns poucos nanómetros por debaixo da superficie da mostra. Os electróns detéctanse cun detector Everhart–Thornley, o cal é un tipo de sistema colector-escintilador-fotomultiplicador. Os electróns secundarios recóllense primeiro atraéndoos cara a unha grella electricamente nesgada a uns +400 V, e despois aceléranse máis cara a unha substancia fosforescente ou escintilador nesgado positivamente a uns +2,000 V. Os electróns secundarios acelerados son agora o suficientemente enerxéticos como para causar que o escintilador emita flashes de luz (catodoluminescencia), que son conducidos a un fotomultiplicador situado fóra da columna do MEV por medio dun tubo de luz e unha ventá na parede da cámara do espécime. A saída do sinal eléctrico amplificado polo fotomultiplicador móstrase como unha distribución de intensidade bidimensional que pode verse e fotografarse sobre unha pantalla de vídeo analóxico ou sometida a unha conversión analóxica a dixital e mostrada e gardada como imaxe dixital. Este proceso depende dun feixe primario que escanea a modo raster. A brillantez do sinal depende do número de electróns secundarios que chegan ao detector. Se o feixe entra na mostra perpendicularmente á superficie, entón a rexión activada é uniforme sobre o eixe do feixe e un certo número de electróns "escapan" desde o interior da mostra. A medida que se incrementa o ángulo de incidencia, o volume de interacción increméntase e a distancia de "escape" dun lado do feixe diminúe, o que ten como resultado a emisión de máis electróns secundarios desde a mostra. As superficies inclinadas e bordos tenden a ser máis brillantes que as superficies planas, o cal orixina imaxes cun aspecto tridimensional ben definido. Usando o sinal dos electróns secundarios é posible unha resolución de imaxe de menos de 0,5 nm.

Detección de electróns retrodispersados

Os electróns retrodispersados (BSE en inglés, de backscattered electrons) consisten en electróns de alta enerxía orixinados no feixe de electróns, que son reflectidos ou retrodispersados fóra do volume de interacción do espécime por interaccións de dispersión elástica con átomos do espécime. Como os elementos pesados (de alto número atómico) retrodispersan electróns máis fortemente que os elementos lixeiros (de baixo número atómico), aparecen máis brillantes na imaxe, polo que os electróns retrodispersados se utilizan para detectar o contraste entre áreas con diferentes composicións químicas. O detector Everhart–Thornley, que se posiciona normalmente a un lado do espécime, non é eficiente para a detección de electrós retrodispersados porque se emiten poucos deses electróns no ángulo sólido subtendido polo detector, e porque a grella de detección nesgada positivamente ten pouca capacidade de atraer os electróns retrodispersados de maior enerxía. Os detectores específicos de electróns retrodispersados sitúanse sobre a mostra nunha disposición tipo "rosquilla", concéntricos co feixe de electróns, maximizando o ángulo sólido de recollida. Os detectores de electróns retrodispersados son xeralmente de tipo escintilador ou de semicondutor. Cando se usan todas as partes do detector para recoller electróns simetricamente respecto do feixe, prodúcese un contraste por número atómico. Porén, prodúcese un forte contraste topográfico recollendo os electróns retrodispersados dun lado por riba do espécime usando un detector de electróns retrodispersados asimétrico ou un bidireccional; o contraste resultante aparece como a iluminación da topografía desde ese lado. Os detectores semicondutores poden facerse de segmentos radiais que poden ser cambiados dentro/fóra para controlar o tipo de contraste producido e a súa direccionalidade.

Os electróns retrodispersados poden tamén usarse para formar unha imaxe de difracción de electróns por retrodispersión que se pode utilizar para determinar a estrutura cristalográfica dun espécime.

Análise de semicondutores por inxección de feixe

A natureza dos electrón enerxéticos de sonda de MEV fainos excepcionalmente axeitados para examinar as propiedades ópticas e electrónicas de materiais semicondutores. Os electróns de alta enerxía do feixe do MEV inxectan portadores de carga dentro do semicondutor. Así, o feixe de electróns perde enerxía ao promover electróns dende a banda de valencia á banda de condución, deixando ocos electrónicos.

Nun material de banda prohibida directa (bandgap), a recombinación destes pares de ocos electrónicos causará catodoluminescia; se a mostra contén un campo eléctrico interno, como o presente nunha unión p-n, a inxección no feixe do MEV de portadores causará un fluxo de corrente inducida polo feixe de electróns. A catodomluminescencia e a corrente inducida polo feixe de electróns denomínanse técnicas de "inxección de feixe" e son sondas moi potentes do comportamento optoelectrónico dos semicondutores, en especial para estudar características a nanoescala e defectos.

Catodoluminescencia

A catodoluminescencia de cor recobre unha imaxe de MEV dun policristal de InGaN. As canles azul e verde representan cores reais, a canle vermella corresponde á emisión UV.

A catodoluminescencia é a emisión de luz cando os átomos excitados por electróns de alta enerxía volven ao seu estado fundamental, que é análoga á fluorescencia inducida por UV, e algúns materiais, como o sulfuro de cinc e algunhas tinguiduras fluorescentes, exhiben ambos os fenómenos. Nas últimas décadas, a catodoluminescencia era normalmente observada como a emisión de luz desde a superficie interna do tubo de raios catódicos en aparellos de televisión e monitores CRT de computador. No MEV, os detectores CL recollen toda a luz emitida polo espécime ou poden analizar as lonxitudes de onda emitidas polo espécime e mostran un espectro de emisión ou unha imaxe da distribución da cardioluminescencia emitida polo espécime en cor real.

Microanálise de raios X

Os raios X característicos que se producen pola interacción dos electróns coa mostra poden tamén detectarse nun MEV equipado para espectroscopia de raios X por dispersión de enerxía ou espectroscopia de raios X por dispersión de lonxitude de onda. A análise de sinais de raios X pode utilizarse para mapar a distribución e estimar a abundancia de elementos na mostra.

Resolución do MEV

Vídeo que ilustra un típico rango de aumentos práctico dun MEV deseñado para espécimes biolóxcios. O vídeo empeza a 25×, uns 6 mm no campo de visión completo, e fai zoom ata 12000×, cuns 12 μm do campo de visión completo. Os obxectos esféricos son boliñas de vidro cun diámetro de 10 μm, similar ao diámetro dun glóbulo vermello do sangue.

O MEV non é unha cámara e o detector non forma continuamente unha imaxe como o faría un dispositivo CCD ou película. A diferenza dun sistema óptico, a resolución non está limitada polo límite de difracción, a finura das lentes ou espellos ou a resolución do dispositivo detector. A óptica de enfoque pode ser grande e grosa, e o detector de electróns secundarios é do tamaño dun puño e simplemente detecta corrente. En vez diso, a resolución espacial do MEV depende do tamaño do punto onde inciden os electróns, o cal á súa vez depende da lonxitude de onda dos electróns e do sistema electrón-óptico que produce o feixe de escaneado. A resolución está tamén limitada polo tamaño do volume de interacción, o volume do material de espécime que interacciona con feixes de electróns. O tamaño de punto (spot size) e o volume de interacción son ambos grandes comparados coas distancias entre os átomos, así que a resolución do MEV non é grande dabondo como para obter imaxes de átomos individuais, como si é posible cun microscopio electrónico de transmisión (MET). Non obstante, o MEV ten vantaxes que compensan isto, incluíndo a capacidade de obter imaxes dunha área comparativamente máis grande do espécime; a capacidade de tomar imaxes de materiais masivos (non só de películas finas ou láminas); e a variedade de modos analíticos dos que dispón para medir a composición e propiedades do espécime. Dependendo do instrumento, a resolución pode estar entre menos de 1 nm e 20 nm. En 2009, o MEV convencional de maior resolución (≤30 kV) do mundo podía acadar unha resolución puntual de 0,4 nm usando un detector de electróns secundario.

MEV ambiental

O MEV convencional require mostras das que se obteñen imaxes no baleiro, porque unha atmosfera de gas espállase rapidamente e atenúa os feixes de electróns. Como consecuencia, as mostras que producen unha cantidade significativa de vapor, por exemplo, as mostras biolóxicas húmidas ou rochas que conteñen petróleo deben secarse primeiro ou conxelarse crioxenicamente. Os procesos que implican transicións de fase, como o secado de adhesivos ou fusión de aliaxes, transporte de líquidos, reaccións químicas e sistemas sólido-aire-gas, en xeral non poden observarse co MEV convencional de alto baleiro. No microscopio electrónico de varrido ambiental (MEVA ou, en inglés, ESEM), evacúase todo o aire da cámara, pero o vapor de auga retense preto da súa presión de saturación, e a presión residual permanece relativamente alta. Isto permite a análise de mostras que conteñen auga ou outras substancias volátiles. Co MEV ambiental tamén son posibles as observacións de insectos vivos.

O primeiro desenvolvemento comercial do MEV ambiental data de finais da década de 1980, o que permitiu a observación de mostras en ambientes gasosos a baixa presión (por exemplo, 1–50 Torr ou 0.1–6.7 kPa) e cunha humidade relativa alta (ata o 100%). Isto fíxose posible polo desenvolvemento dun detector de electróns secundarios capaz de operar en presenza de vapor de auga e polo uso de aperturas limitantes da presión con bombeo diferencial no camiño dos electróns para separar a rexión do baleiro (arredor do canón e lentes) desde a cámara de mostras. O primeiro MEV ambiental comercial fabricouno ElectroScan Corporation en EUA en 1988. ElectroScan foi adquirida por Philips (que máis tarde vendeu a súa división de óptica de electróns á FEI Company) en 1996.

O MEV ambiental é especialmente útil para os materiais non metálicos e biolóxicos, xa que recubrir con carbono ou ouro é inecesario. Os plásticos e elastómeros poden examinarse rutineiramente, como tamén as mostras biolóxicas non recubertas. Isto é útil porque o recubrimento pode ser difícil de reverter, pode agochar pequenas características na superficie da mostra e pode reducir o valor dos resultados obtidos. A análise de raios X é difícil cun recubrimento dun metal pesado, así que se utilizan rutineiramente recubrimentos de carbono nos MEVs convencionais, pero o MEV ambiental fai posible realizar microanálises de raios X de espécimes non condutores non recubertos; porén, introdúcense algunhas particularidades do MEV ambiental na análise de raios X. O MEV ambiental pode ser preferible para a microscopia de electróns de mostras únicas procedentes de actos criminais e civís, onde a análise forense pode ter que ser repetida por diferentes expertos. É posible estudar espécimes en líquido con MEV ambiental ou con outros métodos de microscopia electrónica en fase líquida.

MEV de transmisión (METV ou STEM)

O MEV pode tamén utilizarse no modo de transmisión simplemente incorporando un detector apropiado baixo a sección fina dun espécime delgado. Dispóñense detectores de campo brillante, campo escuro, así como detectores segmentados de campo medio para campo escuro anular de ángulo alto. Malia a diferenza en instrumentación, esta técnica denomínase comunmente microscopia electrónica de tansmisión de varrido (METV ou, en inglés, STEM).

O MEV en ciencias forenses

O MEV utilízase con frecuencia en ciencia forense para análises magnificadas de cousas microscópicas como diatomeas e residuos de disparos. Como o MEV é un procedemento non destrutivo da mostra, pode utilizarse para analizar probas sen danalas. O MEV dispara un feixe de electróns de alta enerxía sobre a mostra, que rebota na mostra sen danala ou cambiala. Isto é excelente cando se queren analizar diatomeas. Cando unha persoa morre por afogamento, inhala auga con diatomeas, que entran no interior do corpo. Estas diatomeas poden ser aumentadas cun MEV para determinar o seu tipo, o cal pode axudar a comprender como e onde se produciu o afogamento da persoa. Usando imaxes de MEV, os forenses poden comparar os tipos de diatomeas para confirmar o corpo de auga no que morreu a persoa.

A análise dos residuos de disparos de armas de fogo pode realizarse con diversos tipos de instrumentos analíticos, pero o MEV é un xeito común de analizar compostos inorgánicos debido a que pode analizar os elementos que o compoñen (principalmente metais) por medio dos seus tres detectores: o detector de electróns retrodispersados, o de electróns secundarios e o de raios X. Os residuos de disparos poden recollerse da escena do crime, da vítima ou do tirador e ser analizados co MEV. Isto axuda a determinar a proximidade ou contacto coa arma de fogo disparada.

Cor no MEV

Os microscopios electrónicos non producen de forma natural imaxes en cor, xa que un MEV produce un só valor por píxel; este valor corresponde co número de electróns recibidos polo detector durante un pequeno período de tempo de escaneado cando o feixe é dirixido á posición de píxel (x, y).

Este único número represéntase normalmente para cada píxel por medio dun nivel ou escala de grises, formando unha imaxe monócroma. Porén, utilízanse varias maneiras de conseguir imaxes en cor de microscopia electrónica.

Cor falsa usando un só detector

• En imaxes compostas de superficies planas (normalmente de electróns retrodispersados):

A maneira máis doada de conseguir cor é asociar a este número único unha cor arbitraria, usando unha táboa de escolla de cores (é dicir, cada nivel de gris é substituído por unha cor elixida). Este método coñécese como cor falsa. Nunha imaxe de electróns retrodispersados, a cor falsa pode realizarse para distinguir mellor as varias fases dunha mostra.

• En imaxes de superficie texturada:

Como alternativa á simple substitución de cada nivel de gris por unha cor, unha mostra observada por un feixe oblicuo permite crear unha imaxe topográfica aproximada (ver o seguinte capítulo "Representación 3D fotométrica dunha soa imaxe de MEV"). Dita topografía pode despois procesarse por medio de algoritmos de representacción 3D para conseguir unha representación máis natural da textura da superficie.

• 
  Superfice dun cálculo renal.
• 
  O mesmo cálculo despois de reprocesar a cor a partir da topografía estimada
• 
  Imaxe de MEV dun Discoaster alterado diaxeneticamente.
• 
  A mesma imaxe anterior despois dunha coloración similar.

Coloración de imaxes de MEV

Moi a miúdo as imaxes publicadas de MEV están coloreadas artificialmente. Isto pode facerse procurando un efecto estético, para deixar máis clara a estrutura ou para engadir unha aparencia realista á mostra e xeralmente non engade información sobre o espécime.

Esta coloración pode facerse manualmente con software de fotoedición, ou semiautomaticamente cun software especializado usando detección de características ou segmentación orientada do obxecto.

• 
  Imaxe de MEV de pole de Cobaea scandens.
• 
  A mesma imaxe despois da coloración semiautomática. As cores arbitrarias axudan a identificar os diversos elementos da estrutura.
• 
  Imaxe de MEV coloreada de pole e estames de Tradescantia.
• 
  Imaxe de MEV coloreada do intercrecemento de ouro nativo e un cristal de arsenopirita.

Construción de cor utilizando múltiples detectores de electróns

Nalgunhas configuracións obtense máis información por píxel, xeralmente usando múltiples detectores.

Como exemplo común, os detectores de electróns secundarios e de electróns retrodispersados sobrepóñense e asígnase unha cor a cada unha das imaxes captadas por cada detector, co resultado dunha imaxe de cores combinadas na que as cores están relacionadas coa densidade dos compoñentes. Este método coñécese como MEV de cor dependente da densidade (MEV-CDD ou, en inglés, DDC-SEM). As micrografías producidas por este método conservan a informaciónn topográfica, a cal a capta mellor o detector de electróns secundarios e combínase coa información sobre a densidade, obtida polo detector de electróns retrodispersados.

• 
  MEV-CDD (DDC-SEM) de partículas calcificadas no tecido cardíaco - Sinal 1 : electróns secundarios
• 
  Sinal 2 : electróns retrodispersados
• 
  Imaxe coloreada obtida das dúas previas. Micrografía de MEV-CDD (DDC-SEM) de calcificación cardiovascular, que mostra en laranxa unha partícula esférica de fosfato de calcio (material máis denso) e en verde a matriz extracelular (material menos denso).
• 
  A mesma imaxe nunha vista máis ampla, parte dun estudo da calcificación dos tecidos cardiovasculares humanos.

Sinais analíticos baseados en fotóns xerados

A medida da enerxía dos fotóns emitidos do espécime é un método común de conseguir máis capacidades analíticas. Exemplos son os detectores de espectroscopia de raios X por dispersión de enerxía usados en análise elemental e os sistemas de micorscopio de catodoluminescencia que analizan a intensidade e espectro da luminescencia inducida por electróns en, por exemplo, espécimes xeolóxicos. Nos sistemas MEV que usan estes detectores é común asignar un código de cor a estes sinais extra e sobrepoñelos nunha soa imaxe en cor para que as diferenzas na distribución dos varios compoñentes do espécime poidan verse claramente e compararse. Opcionalmente, a imaxe de electróns secundarios estándar pode fusionarse cunha ou máis canles composicionais para que se poidan comparar a estrutura e composición do espécime. Ditas imaxes poden facerse mentres conservan a integridade dos datos de sinais orixinais, os cales non son modificados de ningunha maneira.

3D no MEV

Os MEVs non proporcionan imaxes 3D de forma directa a diferenza do microscopio de sonda de escaneado. Porén, poden obterse datos 3D usando un MEV con diferentes métodos como se indica a continuación.

Reconstrución de MEV en 3D a partir dun par estéreo

• A fotogrametría é o método máis exacto metroloxicamente para obter tridimensionalidade nas imaxes de MEV. Ao contrario que os métodos fotométricos (do seguinte parágrafo), a fotogrametría calcula alturas absolutas usando métodos de triangulación. Os inconvenientes son que funciona só se hai un mínimo de textura e cómpre ter dúas imaxes sacadas desde diferentes ángulos, o que implica o uso dunha platina que se poida inclinar. A fotogrametría é unha operación de software que calcula o cambio (ou "disparidade") para cada píxel, entre a imaxe da esquerda e a da dereita do mesmo par. Tal disparidade reflicte a altura local.

• 
  Un par estéreo de MEV de microfósiles dun tamaño de menos de 1 mm (Ostracoda) producido por inclinación ao longo dun eixe lonxitudinal.
• 
  A partir deste par de imaxes de MEV, reconstruíuse a terceira dimensión por fotogrametría (usando o software MountainsSEM; ver seguinte imaxe); despois faise unha serie de representacións 3D con diferentes ángulos e ensámblase nun ficheiro GIF para crear esta animación.
• 
  Reconstrución da superficie 3D dunha mostra de calibración de rugosidade (Ra = 3 µm) (como a usada Para calibrar profilómetros), a partir de dúas imaxes de MEV inclinadas 15° (arriba á esquerda). O cálculo do modelo 3D (abaixo á dereita) tarda uns 1,5 segundos e o erro no valor de rugosidade Ra calculado é de menos de 0,5%.

Reconstrución de MEV fotométrica 3D a partir dun detector de catro cuadrantes por "forma a partir de tonalidade"

Este método usa un detector de electróns retrodispersados de catro cuadrantes (alternativamente un fabricante produce un detector de 3 segmentos). O microscopio produce catro imaxes do mesmo espécime ao mesmo tempo, así que non é necesario inclinar a mostra. O método dá lugar a dimensións 3D metrolóxicas na medida en que a pendente do espécime permanea razoable. A maioría dos fabricantes de MEVs ofrecen agora (en 2018) un detector de electróns retrodispersados de catro cuadrantes integrado no microscopio ou opcional, xunto con software patentado para calcular unha imaxe 3D en tempo real.

Outras estratexias usan métodos máis sofisticados (e ás veces de GPU intensivo) como o algoritmo de estimación óptima e ofrece resultados moito mellores co custo dunha alta esixencia de poder de computación.

En todos os casos, esta estratexia funciona pola integración da pendente, así que as pendentes verticais e as partes que sobresaen colgando son ignoradas; por exemplo, se unha esfera enteira está situada sobre unha superficie plana, o que se ve sobresaír da superficie plana é pouco máis que o hemisferio superior, o que ten como resultado unha altitude incorrecta do ápice da esfera. A prominencia deste efecto depende do ángulo dos detectores de electróns retrodispersados con respecto á mostra, pero eses detectores están xeralmente situados arredor (e preto) do feixe de electróns, así que este efecto é moi común.

Representación 3D fotométrica dunha soa imaxe de MEV

Con este método cómpre obter unha imaxe de MEV cunha iluminación nun ángulo baixo oblicuo. O nivel de grises interprétase despois como a pendente, e a pendente integrada para restaurar a topografía do espécime. Este método é interesante para a mellora visual e a detección da forma e posición de obxectos; porén, as alturas verticais normalmente non poden calibrarse, ao contrario que outros métodos como a fotogrametría.

• 
  Imaxe de MEV da superfice do ollo composto dunha mosca doméstica a un aumento de 450×.
• 
  Detalle da imaxe anterior.
• 
  Reconstrución 3D de MEV a partir da anterior usando os algoritmos de "forma a partir de tonalidade" (shape from shading).
• 
  Igual que a anterior, pero cunha iluminación homoxenizada antes de aplicar os algoritmos de "forma a partir de tonalidade"-

Outros tipos de reconstrución 3D de MEV

• Reconstrución inversa usando modelos interactivos electróns-material
• Reconstrución multirresolución usando un ficheiro 2D: As imaxes 3D de alta calidade poden ser unha última solución para revelar as complexidades de calquera medio poroso, pero obtelas é custoso e leva moito tempo. Por outra parte, as imaxes 2D de MEV de alta calidade están facilmente dispoñibles. Recentemente, presentouse un novo método de reconstrución multirresolución e multiescala en tres pasos que usa directamente imaxes 2D para desenvolver modelos 3D. Este método, baseado na entropía de Shannon e a simulación condicional, pode usarse para a maioría dos materiais estaconarios dispoñibles e poden construírse varios modelos 3D estocásticos simplemente usando unhas poucas seccións finas.
• O MEV de abrasión de ións (en inglés IA-SEM) é un método de imaxes 3D a nanoescala que usa un feixe enfocado de galio para desgastar repetidamente a superficie do espécime de 20 nanómetros dunha vez. Cada superficie exposta é despois escaneada para compilar a imaxe 3D.

Aplicacións do MEV 3D

Unha posible aplicación é medir a rugosidade de cristais de xeo. Este método pode combinar o MEV ambiental de presión variable e as capacidades 3D do MEV para medir a rugosidade en facetas de cristais de xeo individuais, convertelo nun modelo de computador e facer máis análises estatísticas sobre o modelo. Outras medidas inclúen dimensións fractais, examinar a superficie fracturada de metais, a caracterización de materiais, medidas de corrosión e medidas dimensionais a nanoescala (alturas, volume, ángulo, planitude, coplanaridade etc.).^{[Cómpre referencia]}

O MEV tamén se usou por conservadores de arte para distinguir as ameazas que poden afectar á superficie de pinturas debido á súa antigüidade, como a formación de complexos de ións de cinc con ácidos graxos. Os científicos forenses usan o MEV para detrectar falsificacións artísticas.

Galería de imaxes de MEV

Os seguintes son exemplos de imaxes tomadas con MEV.

• 
  Imaxe de MEV coloreada dun nematodo Heterodera glycines e un dos seus ovos. A coloración artificial fai que a imaxe sexa máis fácil de ver por non especialistas e comprender as estruturas e superficies reveladas nas micrografías.
• 
  Ollo composto do crustáceo Euphausia superba. Os ollos de artópodos son un tema común nas micrografías de MEV debido á profundidade do foco que pode captar a imaxe de MEV. Imaxe coloreada.
• 
  Omatidios do krill Euphasia superba, cunha maior magnificación do seu ollo. O MEV cobre un rango que vai desde os aumentos do microscopio óptico ata os do microscopio electrónico de transmisión. Imaxe coloreada.
• 
  Imaxe de MEV de sangue circulante humano normal. Esta é unha micrografía vella e con moito "ruído" dun tema común das micrografías de MEV: os glóbulos vermellos.
• 
  Imaxe de MEV dun hedereloide do Devoniano de Michigan (o diámetro do tubo máis grande é de 0,75 mm). O MEV utilízase amplamente para captar imaxes detalladas de micro e macrofósiles.
• 
  Imaxe de electróns retrodispersados dunha rexión rica en antimonio nun fragmento de cristal antigo. Os museos usan MEVs para estudar artefactos valiosos de maneira non destrutiva.
• 
  Imaxe de MEV dunha capa de fotorresist usada na fabricación de semicondutores tomada nun MEV de emisión de campo. Estes MEVs son importantes na industria dos semicondutores polas súas capacidades de alta resolución.
• 
  Imaxe de MEV da superficie dun cálculo renal mostrando cristais tetragonais de weddellita (dihidrato de oxalato de calcio) saíndo desde a parte central amorfa do cálculo. A lonxitude horizontal da imaxe representa 0,5 mm do orixinal.
• 
  Dúas imaxes da mesmo cristal de neve "azucre", vistos nun microscopio óptico (esquerda) e no MEV (dereita). Nótese como a imaxe do MEV permite unha clara percepción de detalles da estrutura fina que son difíciles de distinguir completamente na imaxe de microscopio óptico.
• 
  Células epidérmicas da superficie interna dunha lámina de cebola. Debaixo das paredes da célula con aspecto de chagrín poden verse os núcleos e pequenos orgánulos flotando no citoplasma. Esta imaxe de electróns retrodispersados dunha mostra tinguida con lantanoide foi tomada sen previa fixación, deshidratación ou recubrimento por pulverización.
• 
  Imaxe de MEV de estomas da superficie inferior dunha folla.

Véxase tamén

Outros artigos

• Microscopio electrónico
• Espectroscopia de raios X por dispersión de enerxía
• Microscopio de catodoluminescencia
• Microscopia
• Microscopio electrónico de transmisión

Ligazóns externas

Xeral

• HowStuffWorks – How Scanning Electron Microscopes Work
• Learn to use an SEM – Un ambiente de aprendizaxe on line para persoas que queren usar un MEV. Proporcionado por Microscopy Australia
• Virtual SEM – sparkler - unha simulación intensiva dun microscopio electrónico de varido (MEV)
• Imaxes de MEV de cor multicanle - e con electróns electrodispersados
• Exemplos de imaxes de DDC-SEM
• Vídeo sobre o microscopio electrónico de varido, Universidade de Karlsruhe de Ciencias Aplicadas
• Animacións e explicacións de varios tipos de microscopios incluíndo microscopios electrónicos (Université Paris Sud)

Historia

• Historia do microscopio electrónico de varrido ambiental (ESEM)

Imaxes

• Rippel Electron Microscope Facility Arquivado 19 de marzo de 2007 en Wayback Machine. Ducias de imaxes de MEV (a maioría biolóxicas) do Dartmouth College.
• Tinguidura con lantanoide - Imaxes de MEV do Instituto de Investigación de Doenzas do Ollo, Moscova.