Urease

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Urease
Urease-1E9Z.jpg
Urease de Helicobacter pylori de PDB 1E9Z.
Identificadores
Número EC 3.5.1.5
Número CAS 9002-13-5
Bases de datos
IntEnz vista de IntEnz
BRENDA entrada de BRENDA
ExPASy vista de NiceZyme
KEGG entrada de KEGG
MetaCyc vía metabólica
PRIAM perfil
Estruturas PDB RCSB PDB PDBe PDBsum

As ureases[1], son encimas que funcionalmente pertencen á superfamilia das amidohidrolases e fosfotriesterases.[2] Son metaloencimas de elevado peso molecular que conteñen níquel. Catalizan a hidrólise da urea a dióxido de carbono e amoníaco mediante a seguinte reacción:

(NH2)2CO + H2OCO2 + 2NH3

Máis especificamente, a urease cataliza a hidrólise da urea para producir amoníaco e carbamato, e posteriormente o carbamato se degrada por hidrólise espontánea producindo outra molécula de amoníaco e dióxido de carbono. Por tanto, o dióxido de carbono fórmase en dous pasos.[3] A actividade da urease tende a incrementar o pH (faise máis básico) no medio, xa que produce amoníaco, unha molécula básica. As ureases están presentes en moitas bacterias, fungos, algas, plantas e algúns invertebrados, e tamén en solos, como un encima liberado no solo.[4]

En 1926, James Batcheller Sumner, na Universidade Cornell, demostrou que a urease era unha proteína ao examinar a súa forma cristalizada.[5] O traballo de Sumner foi a primeira demostración de que unha proteína pura podía funcionar como encima, e o que levou ao recoñecemento de que a maioría[6] dos encimas son proteínas, e valeulle a concesión do Premio Nobel de Química de 1946.[7] A urease foi o primeiro encima que foi cristalizado. A estrutura da urease foi resolta por primeira vez por P. A. Karplus en 1995.[5]

Características[editar | editar a fonte]

As ureases bacterianas están compostas por tres subunidades distintas, unha grande (α de 60–76kDa) e dúas pequenas (β de 8–21 kDa, e γ de 6–14 kDa), que xeralmente teñen unha estequiometría trímera (αβγ)3 cunha estrutura simétrica (nótese que a imaxe de arriba mostra a estrutura da unidade asimétrica, que é un terzo da verdadeira ensamblaxe biolóxica), e son encimas ricos en residuos de cisteína, os cales supoñen no encima unha masa de entre 190 e 300kDa.[10]

Un encima excepcional é a urease das bacterias Helicobacter, que está composta por dúas subunidades, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa), e forma un complexo supramolecular dodecamérico[11] de subunidades repetidas α-β, e cada par acoplado de subunidades ten un sitio activo, cun total de 12 sitios activos[11] (). Exerce unha función esencial para a supervivencia da bacteria, ao neutralizar o ácido gástrico permitindo que a urea entre no periplasma bacteriano por medio dun canal de urea de apertura regulada por protóns.[12] A detección da presenza de urease utilízase para a diagnose das infeccións por Helicobacter pylori.

Todas as ureases bacterianas son exclusivamente citoplasmáticas (intracelulares), agás no caso da urease de H. pylori, que xunto coa súa actividade intracelular, ten unha actividade externa coas células hóspede. Todas as ureases de plantas son citoplasmáticas.[10]

As ureases de fungos e plantas están feitas de subunidades idénticas (de ~90 kDa), normalmente ensambladas en trímeros e hexámeros. Por exemplo, a urease do feixón Canavalia ensiformis ten dúas subunidades estruturais e unha catalítica. A subunidade α contén o sitio activo, está composta por 840 aminoácidos por molécula (con 90 cisteínas), a súa masa molecular sen contar os ións de Ni(II) é de 90,77 kDa. A masa do hexámero cos seus 12 ións níquel é de 545,34 kDa. Está estruturalmente relacionada co trímero (αβγ)3 das ureases bacterianas. Outros exemplos de estruturas homohexaméricas de ureases de plantas son as da soia, das sementes de algodón e da fabácea Cajanus cajan.[10]

Hai que salientar que, aínda que están compostas por distintos tipos de subunidades, as ureases de diferentes fontes, desde as bacterianas ás de plantas e fungos, mostran unha grande homoloxía nas súas secuencias de aminoácidos.[10]

Sitio activo[editar | editar a fonte]

O sitio activo de todas as ureases coñecidas está situado na subunidade alfa. É un centro de níquel dimérico bis-μ-hidroxo, cunha distancia interatómica de ~3,5 Å;[5] experimentos de susceptibilidade magnética na urease de Canavalia ensiformis indicaron que, os ións de Ni(II) coordinados octaedricamente con alto spin están feblemente acoplados antiferromagneticamente.[13] Os ións níquel están ponteados por unha lisina carbamilada por medio dos seus átomos de oxíxeno e por un ión hidróxido. O Ni(1) está coordinado por átomos de N de residuos de histidinas e unha molécula de auga. Ni(2) está coordinado por dúas histidinas tamén por medio de átomos de N e adicionalmente por ácido aspártico por medio dos seus átomos de O e dúas moléculas de auga.[14] Os estudos de espectroscopía de absorción de raios X (XAS) da urease de Canavalia ensiformis, Klebsiella aerogenes e Sporosarcina pasteurii (antes chamada Bacillus pasteurii)[14] confirman que hai 5–6 ións níquel coordinados exclusivamente con ligandos O/N (dous imidazois por níquel).[9]

As moléculas de auga están localizadas cara á abertura do sitio activo e forman un grupo tetraédrico que enche o sitio da cavidade con enlaces de hidróxeno, e aquí é onde se une a urea ao sitio activo para que teña lugar a reacción, desprazando as moléculas de auga. Os residuos de aminoácidos participan na unión do substrato, principalmente por medio de enlaces de hidróxeno, estabilizan o estado de transición catalítico e aceleran a reacción. Ademais, os residuos de aminoácidos implicados na arquitectura do sitio activo compoñen parte da solapa móbil do sitio, a cal actúa como unha cancela para o substrato.[4] Os residuos de cisteína son comúns na rexión da solapa dos encimas, pero determinouse que non son esenciais na catálise, aínda que están implicados en posicionar outros residuos claves correctamente no sitio activo.[15] Na estrutura da urease de Sporosarcina pasteurii a solapa encóntrase na súa conformación aberta, e a súa conformación pechada é aparentemente necesaria para a reacción.[14]

Cando se comparan as subunidades α da urease de Helicobacter pylori e outras ureases bacterianas alíñanse coa urease da planta Canavalia ensiformis, o que suxire que todas as ureases son variantes evolutivas dun encima ancestral.[15]

Hai que salientar que a coordinación da urea no sitio activo da urease nunca foi observada no estado de repouso do encima.[10]

Actividade[editar | editar a fonte]

A kcat/Km da urease no procesamento da urea é 1014 veces maior que a velocidade da reacción de eliminación non catalizada da urea.[5] A proximidade da urea a grupos activos do sitio activo xunto coa correcta orientación da urea permiten que a hidrólise ocorra moi rapidamente. A urea soa (sen a presenza do encima) é moi estable debido ás formas de resonancia que pode adoptar. A estabilidade da urea débese á súa enerxía de resonancia, que foi estimada en 30–40 kcal/mol.[5] Todas as formas de resonancia zwitteriónicas doan electróns ao carbono carbonilo facéndoo menos electrófilo e menos reactivo a un ataque nucleofílico.[5]

Mecanismos propostos[editar | editar a fonte]

Blakeley/Zerner[editar | editar a fonte]

Un mecanismo para explicar a catálise desta reacción pola urease foi proposto por Blakely e Zerner.[16] A reacción comeza cun ataque nucleofílico polo oxíxeno do carbonilo da molécula de urea sobre o Ni con coordinación 5 (Ni-1). Un ligando de auga debilmente coordinado é desprazado no seu lugar. Un par solitario de electróns dun dos átomos de nitróxeno da molécula de urea crea un dobre enlace co carbono central, e o NH2+ resultante do substrato coordinado interacciona cun grupo próximo cargado negativamente. Blakeley e Zerner propuxeron que este grupo próximo era un ión carboxilato.

Unha base desprotona un ligando hidróxido no Ni con coordinación 6. O carbono carbonílico sofre seguidamente o ataque dun oxíxeno electronegativo. Un par de electróns do dobre enlace nitróxeno-carbono volve ao nitróxeno e neutraliza a carga que había nel, mentres que o carbono con coordinación 4 adopta unha orientación tetraédrica intermedia.

Na rotura deste intermediario colabora despois un grupo sulfhidrilo dunha cisteína localizada preto do sitio activo do encima. Un hidróxeno enlázase a un dos átomos de nitróxeno, rompendo os seus enlaces co carbono, e liberando unha molécula de NH3. Simultaneamente, rompe o enlace entre o oxíxeno e o Ni con corrdinación 6. Isto deixa un ión carbamato coordinado ao Ni con corrdinación 5, que é despois desprazado por unha molécula de auga, rexenerando o encima.

O carbamato producido degrádase despois espontaneamente para producir outra molécula de amoníaco e ácido carbónico.[3]

Hausinger/Karplus[editar | editar a fonte]

O mecanismo proposto por Hausinger e Karplus trata de revisar algúns dos problemas que se daban na vía de Blakely e Zerner, e está enfocado ás posicións das cadeas laterais que forman ao peto de unión da urea.[5] Baseándose nas estruturas cristalinas da urease da bacteria Klebsiella aerogenes, considerouse que a base xeral utilizada no mecanismo de Blakely, que era a His320, estaba demasiado lonxe da auga unida ao Ni2 para desprotonarse para formar o residuo de hidróxido atacante. Ademais, non se identificou o ligando ácido xeral que cómpre para protonar o nitróxeno da urea.[17] Hausinger e Karplus suxiren un esquema de protonación inversa, no cal unha forma protonada do ligando His320 xoga o papel do ácido xeral, e a auga unida ao Ni2 está xa no estado desprotonado.[5] O mecanismo segue a mesma vía, pero omite a base xeral (xa que non se necesita), e a His320 doa o seu protón para formar a molécula de amoníaco, que despois se libera do encima. Aínda que a maioría dos ligandos His320 e a auga unida non están nas súas formas activas (protonada e desprotonada, respectivamente), calculouse que aproximadamente o 0,3% do encima urease total estaría sempre activo.[5] Aínda que loxicamente, isto implicaría que o encima non é moi eficiente, en contra do coñecemento establecido que se ten del, o uso do esquema de protonación inversa proporciona unha vantaxe no incremento da reactividade para a forma activa, compensando a desvantaxe.[5] Ao situar o ligando His320 como un compoñente esencial do mecanismo tamén se ten en conta a rexión solapa móbil do encima. Como este ligando histidina forma parte da solapa móbil, a unión do substrato urea para a catálise pecha esta solapa sobre o sitio activo, e coa adición do patrón de enlaces de hidróxeno da urea con outros ligandos no peto, explícase a selectividade do encima pola urea.[5]

Ciurli/Mangani[editar | editar a fonte]

O mecanismo proposto por Ciurli e Mangani[18] é un dos máis recentes a aceptados actualmente para explicar a catálise realizada pola urease, e está baseado principalmente nos diferentes papeis dos dous ións níquel do sitio activo.[14] Un deles únese á urea e actívaa, mentres que o outro ión níquel se une á molécula de auga nucleofílica, activándoa.[14] Nesta proposta, a urea entra na cavidade do sitio activo cando está aberta a solapa móbil. A estabilidade da unión da urea no sitio activo conséguese por medio dunha rede de enlaces de hidróxeno, que orientan o substrato na cavidade catalítica.[14] A urea únese ao Ni con coordinación 5 (Ni1) co seu átomo de oxíxeno carbonílico. Aproxímase ao Ni con coordinación 6 (Ni2) por un dos seus grupos amino e seguidamente fai de ponte entre os dous centros de níquel.[14] A unión do átomo de oxíxeno carbonílico da urea ao Ni1 está estabilizada polo estado de protonación da Hisα222 Nԑ. Ademais, o cambio conformacional desde o estado aberto ao pechado da solapa móbil xera un rearranxo do grupo carbonilo da Alaα222 de tal maneira que o seu átomo de oxíxeno apunta cara ao Ni2.[14] As Alaα170 e Alaα366 están agora orientadas de modo que os seus grupos carbonilo actúan como aceptores de enlaces de hidróxeno cara ao grupo NH2 da urea, o que axuda á súa unión ao Ni2.[14] A urea é un ligando quelante moi pobre debido ao baixo carácter de base de Lewis dos seus grupos NH2. Porén, os oxíxenos carbonílicos da Alaα170 e Alaα366 potencian a basicidade dos grupos NH2 e permiten que se unan ao Ni2.[14] Por tanto, neste mecanismo, o posicionamento da urea no sitio activo é inducido polas características estruturais dos residuos do sitio activo, que están situados para actuar como doantes nos enlaces de hidróxeno nas proximidades do Ni1 e como aceptores nas proximidades do Ni2.[14] A principal diferenza estrutural entre o mecanismo de Ciurli/Mangani e os outros dous é que incorpora unha urea que fai de ponte cun nitróxeno e un oxíxeno, que é atacada por un hidróxido que fai de ponte.[3]

Acción na patoxénese[editar | editar a fonte]

As ureases bacterianas son con frecuencia as que orixinan a patoxénese en moitas condicións médicas. Están asociadas coa encefalopatía hepática / coma hepático, cálculos de infección urinaria, e úlceras pépticas.[19]

Cálculos de infección urinaria[editar | editar a fonte]

Os cálculos urinarios inducidos por infeccións son unha mestura de estruvita (MgNH4PO4•6H2O) e carbonato apatita [Ca10(PO4)6•CO3].[19] Estes ións polivalentes son solubles pero fanse insolubles cando as ureases microbianas producen amoníaco durante a hidrólise da urea, xa que este composto incrementa o pH da área onde se produce de 6,5 a 9.[19] A alcalinización resultante orixina a cristalización dos cálculos.[19] Nos humanos a infección por Proteus mirabilis, é a máis común das que inducen a formación de cálculos urinarios.[20]

Na encefalopatía hepática / coma hepático[editar | editar a fonte]

A infección pola bacteria Helicobacter pylori xunto con cirrose hepática causan encefalopatía hepática e coma hepático.[21] Helicobacter pylori produce ureases microbianas no estómago. As ureases hidrolizan a urea producindo amoníaco e ácido carbónico. Como as bacterias están situadas no estómago, o amoníaco producido é rapidamente captado polo sistema circulatorio desde o lume gástrico.[21] Isto ten como resultado o aumento dos niveis de amoníaco no sangue (hiperamonemia), mentres que a eradicación de Heliobacter pylori causa unha marcada diminución dos niveis de amoníaco.[21]

En úlceras pépticas[editar | editar a fonte]

Helicobacter pylori é tamén unha causa frecuente de úlceras pépticas, e está presente no 55–68% dos casos. A súa presenza pódese detectar mediante a proba rápida da urease.[22] Neses casos prodúcese un incremento do pH no revestimento mucoso do estómago como resultado da hidrólise da urea, o que impide o movemento de ións hidróxeno entre as glándulas gástricas da mucosa (onde están as células parietais produtoras de ácido clorhídrico) e o lume do estómago.[19] Ademais, as altas concentracións de amoníaco afectan ás unións herméticas intercelulares, incrementando a permeabilidade e tamén alterando a mucosa gástrica.[19]

Proba de diagnóstico[editar | editar a fonte]

Moitos patóxenos dos tractos gastrointestinais ou urinarios producen urease, polo que se pode usar a detección da urease como unha proba de diagnóstico da presenza de ditos patóxenos.

Patóxenos urease positivos son:

Outros usos[editar | editar a fonte]

Poden utilizarse biosensores condutométricos de urease para a detección de metais pesados, que consisten en eléctrodos de ouro interdixitados e membranas encimáticas formadas nas súas partes sensibles, que permiten a estimación cuantitativa da polución de auga xeral con ións de metais pesados. Os metais son tóxicos para a actividade da urease. A secuencia de ións de metais en relación coa súa toxicidade para a urease é: Hg2+ > Cu2+ > Cd2+ > Co2+ > Pb2+ > Sr2+ >. As condicións para as aplicacións prácticas destes biosensores están a ser investigadas para a súa optimización. Demostrouse a reactivación por EDTA da urease despois da súa inhibición polos metais pesados.[1]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. (EC 3.5.1.5)
  2. L. Holm, C. Sander, Proteins 28 (1997) 72–82.
  3. 3,0 3,1 3,2 Zimmer, Marc (Apr 2000). "Molecular mechanics evaluation of the proposed mechanisms for the degradation of urea by urease". J Biomol Struct Dyn. 17 (5): 787–97. PMID 10798524. doi:10.1080/07391102.2000.10506568. Consultado o 2013-04-29. 
  4. 4,0 4,1 Krajewska, Barbara; Eldik, Rudi; Brindell, Małgorzata (13 August 2012). "Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism". JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry 17 (7): 1123–1134. PMC 3442171. PMID 22890689. doi:10.1007/s00775-012-0926-8. 
  5. 5,00 5,01 5,02 5,03 5,04 5,05 5,06 5,07 5,08 5,09 5,10 Karplus, P. A., Pearson, M. A., & Hausinger, R. P. (1997). 70 years of crystalline urease: What have we learned? Accounts of Chemical Research, 30(8), 330–337
  6. Existen tamén os ribocimas de ARN.
  7. The Nobel Prize in Chemistry 1946
  8. nickel in biology
  9. 9,0 9,1 Carter, Eric L.; Flugga, Nicholas; Boer, Jodi L.; Mulrooney, Scott B.; Hausinger, Robert P. (1 January 2009). "Interplay of metal ions and urease". Metallomics 1 (3): 207–21. PMC 2745169. PMID 20046957. doi:10.1039/b903311d. 
  10. 10,0 10,1 10,2 10,3 10,4 10,5 Krajewska, Barbara (30 June 2009). "Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review". Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 59 (1–3): 9–21. doi:10.1016/j.molcatb.2009.01.003. 
  11. 11,0 11,1 Ha, Nam-Chul; Oh, Sang-Taek; Sung, Jae Young; Cha, Kyeung Ah; Lee, Mann Hyung; Oh, Byung-Ha (31 May 2001). "Supramolecular assembly and acid resistance of Helicobacter pylori urease". Nature Structural Biology 8 (6): 505–509. PMID 11373617. doi:10.1038/88563. 
  12. Strugatsky, David; McNulty, Reginald; Munson, Keith; Chen, Chiung-Kuang; Soltis, S. Michael; Sachs, George; Luecke, Hartmut (8 December 2012). "Structure of the proton-gated urea channel from the gastric pathogen Helicobacter pylori". Nature 493 (7431): 255–258. PMID 23222544. doi:10.1038/nature11684. 
  13. Coordination Chemistry Reviews 190–192 (1999) 331–355
  14. 14,00 14,01 14,02 14,03 14,04 14,05 14,06 14,07 14,08 14,09 14,10 Benini, Stefano; Rypniewski, Wojciech R; Wilson, Keith S; Miletti, Silvia; Ciurli, Stefano; Mangani, Stefano (31 January 1999). "A new proposal for urease mechanism based on the crystal structures of the native and inhibited enzyme from Bacillus pasteurii: why urea hydrolysis costs two nickels". Structure 7 (2): 205–216. PMID 10368287. doi:10.1016/S0969-2126(99)80026-4. 
  15. 15,0 15,1 Martin, PR; Hausinger, RP (Oct 5, 1992). "Site-directed mutagenesis of the active site cysteine in Klebsiella aerogenes urease". The Journal of biological chemistry 267 (28): 20024–7. PMID 1400317. 
  16. Dixon, NE; Riddles PW; Blakeley RL; Zerner B (1979). "Jack Jack Bean Urease (EC3.5.1.5). V. On the Mechanism of action of urease on urea, formamide, acetamide,N-methylurea, and related compounds". Canadian Journal of Biochemistry 58 (12): 1335–1344. PMID 6788353. doi:10.1139/o80-181. 
  17. Jabri, E; Carr, MB; Hausinger, RP; Karplus, PA (May 19, 1995). "The crystal structure of urease from Klebsiella aerogenes". Science 268 (5213): 998–1004. PMID 7754395. doi:10.1126/science.7754395. 
  18. Zambelli, Barbara; Musiani, Francesco; Benini, Stefano; Ciurli, Stefano (19 July 2011). "Chemistry of Ni2+ in Urease: Sensing, Trafficking, and Catalysis". Accounts of Chemical Research 44 (7): 520–530. PMID 21542631. doi:10.1021/ar200041k. 
  19. 19,0 19,1 19,2 19,3 19,4 19,5 Mobley, HL; Hausinger, RP (March 1989). "Microbial ureases: significance, regulation, and molecular characterization". Microbiological reviews 53 (1): 85–108. PMC 372718. PMID 2651866. 
  20. Rosenstein, Isobel J. M.; Griffith, Donald P. (1 January 1986). "Urinary Calculi: Microbiological and Crystallographic Studies". Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 23 (3): 245–277. PMID 3524996. doi:10.3109/10408368609165802. 
  21. 21,0 21,1 21,2 Agrawal, Avinash; Gupta, Alok; Chandra, Mam; Koowar, Sciddhartha (17 March 2011). "Role of Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of minimal hepatic encephalopathy and effect of its eradication". Indian Journal of Gastroenterology 30 (1): 29–32. PMID 21416318. doi:10.1007/s12664-011-0087-7. 
  22. Tang, JH; Liu, NJ; Cheng, HT; Lee, CS; Chu, YY; Sung, KF; Lin, CH; Tsou, YK; Lien, JM; Cheng, CL (February 2009). "Endoscopic diagnosis of Helicobacter pylori infection by rapid urease test in bleeding peptic ulcers: a prospective case-control study". Journal of clinical gastroenterology 43 (2): 133–9. PMID 19230239. doi:10.1097/MCG.0b013e31816466ec. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Bibliografía[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]