Taq polimerase

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.


Taq polimerase, exonuclease
Taq.png
ADN polimerase unida a un octámero de ADN
Identificadores
Símbolo Taq-exonuc
Pfam PF09281
InterPro IPR015361
SCOP 1qtm
SUPERFAMILY 1qtm
Taq-exonuc
PDB 1ktq EBI.jpg
ADN polimerase
Identificadores
Símbolo Taq-exonuc
Pfam PF09281
InterPro IPR015361
SCOP 1qtm
SUPERFAMILY 1qtm

O encima Taq polimerase (ou ADN polimerase Taq), abreviada como "Taq Pol" ou simplemente "Taq", é unha ADN polimerase termoestable (non se desnaturaliza a altas temperaturas) que procede da bacteria termófila Thermus aquaticus e que se usa moito no laboratorio na técnica da PCR, un método para amplificar a cantidade de curtos segmentos de ADN. Foi illada da mencionada bacteria en 1965 por Thomas D. Brock.[1]

T. aquaticus é unha bacteria que vive en fontes termais. A Taq polimerase foi identificada[1] como un encima que pode resistir as condicións normalmente desnaturalizantes (como a alta temperatura) utilizadas durante a PCR.[2] Este encima substituíu a ADN polimerase de Escherichia coli, que era a que se usaba orixinalmente na PCR, que é moito menos resistente.[3] A temperatura óptima para a Taq polimerase é de 75–80°C, cunha vida media maior de 2 horas a 92,5°C, e de 40 minutos a 95°C, e de 9 minutos a 97,5°C, e pode replicar unha cadea de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10 segundos a 72°C.[4]

Unha das desvantaxes da Taq é a súa relativamente baixa fidelidade de replicación. A Taq natural carece de actividade exonuclease 3'-5' de corrección de erros (proofreading),[4] e ten unha taxa de erro de arredor de 1 de cada 9.000 nucleótidos.[5] [6] Illáronse algunhas outras ADN polimerases termoestables doutras bacterias termofílicas e arqueas, como a ADN polimerase Pfu, que si teñen actividade de corrección de erros, e úsanse en lugar (ou en combinación) da Taq para facer unha amplificación de maior fidelidade.

A Taq polimerase orixina produtos de ADN nos que sobresae polos seus extremos 3' adenina (A). Isto pode ser útil para a clonación TA, polo que e uitiliza un vector de clonación (como un plásmido) do que sobresae unha timina (T) en 3', que se complementa coa A que sobresae do produto da PCR, o que permite a ligación do produto da PCR no plásmido vector.

Probáronse diversas modificacións provocadas na Taq polimerase para mellorar o seu rendemento.[7]

A Taq polimerase na PCR[editar | editar a fonte]

A comezos da década de 1980, Kary Mullis estaba traballando na aplicación de ADNs sintéticos á biotecnoloxía. Tiña traballado con oligonucleótidos de ADN, que se usaban como sondas que se unían a fibras de ADN diana, ou se usaban como cebadores para a secuenciación do ADN e na síntese de ADNc. En 1983, empezou a usar dous cebadores, un para hibridarse a cada fibra dun ADN diana, e engadiu ADN polimerase á reacción. Isto deu lugar a unha replicación do ADN expoñencial,[8] que amplificou enormente as cantidades de ADN entre os cebadores.[3]

Porén, despois de cada rolda de replicación a mestura tiña que ser quentada por riba dos 90°C para desnaturalizar o ADN acabado de formar, é dicir, para que se separasen as súas dúas cadeas e puidesen actuar como moldes na seguinte rolda de amplificación. Este paso de elevación da temperatura inactivaba a ADN polimerase I de E. coli (fragmento de Klenow) que se usaba antes do descubrimento da Taq polimerase.

O uso da Taq polimerase termoestable evita a necesidade de ter que engadir novos encimas (non desnaturalizados) á reacción da PCR durante o proceso de termociclado. O proceso enteiro pode levarse a cabo nun simple tubo pechado nunha máquina relativamente simple (termociclador). Deste xeito, o uso da Taq polimerase foi a idea chave que fixo que a PCR fose aplicable a unha grande variedade de problemas e experimentos de bioloxía molecular que tiñan que ver coa análise do ADN.[2]

Patentes[editar | editar a fonte]

As patentes da PCR e Taq pertencían a Cetus Corporation na que estaba traballando Hary Mullis. Finalmente, Hoffmann-La Roche comprou as patentes da PCR e Taq a Cetus por 330 millóns de dólares, e por elas chegaría despois a recibir 2.000 millóns en dereitos.[9] En 1989, a revista Science elixiu á Taq polimerase como a súa primeira "molécula do ano". Kary Mullis recibiu o Premio Nobel de Química en 1993, o único que se outorgou por unha investigación realizada nunha empresa privada de biotecnoloxía. A comezos da década de 1990, a técnica da PCR co uso da Taq polimerase utilizábase en moitas áreas, como a investigación básica en bioloxía molecular, probas clínicas, e forenses. Posteriormente empezou a usarse na detección do VIH, virus causante da SIDA.[10]

A compañía Hoffman-La Roche foi demandada nos tribunais por Promega corporation por problemas coa patente. En 1999 os tribunais dictaminaron que a patente de 1990 que implicaba a Taq polimerase emitiuse en parte debido a información enganosa e afirmacións falsas dos científicos de Cetus Corporation, o que daba a razón ao demandante. O xuíz citou descubrimentos previos realizados por outros laboratorios, como o laboratorio de John Trela na Universidade de Cincinnati.[11]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. 1,0 1,1 Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bact. 127 (3): 1550–7. PMC 232952. PMID 8432. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=232952.
  2. 2,0 2,1 Saiki, RK; et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.". Science 239 (4839): 487–91. DOI:10.1126/science.2448875. PMID 2448875. http://sunsite.berkeley.edu/cgi-bin/ebind2html/pcr/009.
  3. 3,0 3,1 Saiki, RK; et al. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science 230 (4732): 1350–4. DOI:10.1126/science.2999980. PMID 2999980. http://sunsite.berkeley.edu/cgi-bin/ebind2html/pcr/034.
  4. 4,0 4,1 Lawyer FC, et al. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase ...". PCR Methods Appl. 2 (4): 275–87. PMID 8324500.
  5. Tindall KR and Kunkel TA (1988). "Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase". Biochemistry 27 (16): 6008–13. DOI:10.1021/bi00416a027. PMID 2847780.
  6. Bu Z, Biehl R, Monkenbusch M, Richter D, Callaway DJ (December 2005). "Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (49): 17646–51. DOI:10.1073/pnas.0503388102. PMC 1345721. PMID 16306270. http://www.pnas.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=16306270.
  7. Li Y, Mitaxov V, Waksman G (August 1999). "Structure-based design of Taq DNA polymerases with improved properties of dideoxynucleotide incorporation". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (17): 9491–6. PMC 22236. PMID 10449720. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=22236.
  8. Mullis KB (April 1990). "The unusual origin of the polymerase chain reaction". Sci. Am. 262 (4): 56–61, 64–5. DOI:10.1038/scientificamerican0490-56. PMID 2315679.
  9. Fore J, Wiechers IR, Cook-Deegan R (2006). "The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study". J Biomed Discov Collab 1: 7. DOI:10.1186/1747-5333-1-7. PMC 1523369. PMID 16817955. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1523369.
    Detailed history of Cetus Corporation and the commercial aspects of PCR.
  10. Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (1 April 1989). "Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infection". Clin. Microbiol. Rev. 2 (2): 217–26. PMC 358112. PMID 2650862. http://cmr.asm.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=2650862.
  11. Curran, Chris, Bio-Medicine, Dec. 7, 1999

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]


Commons
Commons ten máis contidos multimedia sobre: Taq polimerase