Cromatografía

Cromatografía (do grego χρώμα: cor e γραφειν: escribir) é o termo colectivo para unha familia de técnicas de laboratorio para separación de mostras. Implican o paso dunha mestura disolta nunha "fase móbil" a través dunha "fase estacionaria", que separa o analito a medir doutras moléculas na mestura, permitindo o seu illamento.

A cromatografía pode ser preparativa ou analítica. A cromatografía preparativa busca separar os compoñentes dunha mestura para un uso posterior (é un xeito de purificación). A cromatografía analítica normalmente opera con cantidades pequenas de material e busca medir as proporcións relativas de analitos nunha mestura. Ámbalas dúas non son excluíntes.

Explicación

Unha analoxía de utilidade é supoñer unha mestura de abellas e nespras pasando sobre unha campa de flores. As abellas será máis atraídas polas flores que as nespras, e así sepáranse delas. Se alguén observa nun punto máis alá da campa, as abellas pasan en primeiro lugar, seguidas das abellas. Nesta analoxía, as abellas e as nespras representan os analitos que serán separados, as flores representan a fase estacionaria, e a fase móbil é o ar. A chave da separación é a diferenza de afinidades entre o analito, a fase estacionaria e a fase móbil. O observador pode representar o detector utilizado nalgunhas variantes de cromatografía analítica. O punto chave é que o detector non necesita ser capaz de discriminar entre analitos, xa que lle chegan separados.

Historia

Foi o botánico ruso Mikhail Semyonovich Tsvet o que inventou a primeira técnica de cromatografía en 1900 durante as súas investigacións da clorofila. Utilizou unha columna de adsorción líquida que contiña carbonato cálcico para separar pigmentos de plantas. O método describiuno o 30 de decembro de 1901 no 11º Congreso de Naturalistas e Doutores (XI съезд естествоиспытателей и врачей) en San Petesburgo. A primeira descrición foi en 1903, en Procedementos da Sociedade Varsova de Naturalistas, sección de bioloxía. Empregou por vez primeira o termo cromatografía impreso en 1906 nos seus dous artigos sobre a clorofila na revista xermana de botánica Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. En 1907 fixo unha demostración do seu cromatógrafo para a Sociedade Botánica Xermana. Como curiosidade, o apelido de Mikhail "Цвет" significa "cor" en ruso, así que cabe a posibilidade que a denominación do proceso cromatográfico (que significa literalmente "escribir cores") fora unha forma de asegurarse de que el, un obreiro da Rusia tsarista, fose inmortalizado.

En 1952 Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge foron galardoados co Premio Nobel de Química pola súa invención da cromatografía de separación . Dende entón, a tecnoloxía avanzou rapidamente. Os investigadores acharon que os principios da cromatografía de Tsvet podían ser aplicados de moitas formas diferentes, poñendo a punto as diferentes variedades de cromatografía que se describen a continuación. Simultaneamente continúase mellorando o rendemento da cromatografía continuamente, permitindo a separación de moléculas cada vez máis semellantes.

Termos en cromatografía

• O analito é a substancia que se vai separar durante a cromatografía.
• A cromatografía analítica utilízase para determinar a existencia e posiblemente a concentración do(s) analito(s) na mostra.
• A fase ligada e unha fase estacionaria que se une covalentemente ás partículas de soporte na cara interna da columna.
• O cromatograma é a representación visual da cromatografía. No caso de separacións óptimas, aparecen diferentes picos ou patróns no cromatograma correspondentes a diferentes compoñentes na mestura separada.

No eixo x amósase o tempo de retención e no eixo e un sinal (obtido por exemplo por espectroscopía UV, espectroscopía de masas ou outro tipo de detectores) correspondentes á resposta creada polo analito que sae do sistema. No caso dun sistema óptimo o sinal é proporcional á concentración do analito separado.

• O cromatógrafo é o equipo que permite a separación sofisticada, como pode ser un cromatógrafo de gases ou un cromatógrafo de líquidos.
• Cromatografía é o método físico de separación no que os compoñentes a ser separados son distribuídos entre dúas fases, unha delas é estacionaria e a outra (fase móbil) desprázase nunha dirección determinada.
• O efluente é a fase móbil que sae da columna.
• A fase estacionaria é unha fase inmóbil que está fixada en partículas de soporte ou na cara interna da columna.
• A fase móbil é a fase que se move nunha dirección definida. Pode ser un líquido (LC e CEC), un gas (GC) ou un fluído supercrítico (SFC).
• A cromatografía de preparación emprégase para purificar de xeito non destrutivo cantidades suficientes para un uso posterior, máis alá da análise.
• O tempo de retención é o tempo característico que lle leva a un analito en particular pasar a través de todo o sistema, desde a inxección na columna ata o detector, baixo as condicións preestablecidas.
• A mostra é o material analizado na cromatografía. Pode consistir nun compoñente simple ou unha mestura de compoñentes. Cando a mostra se trata durante a análise, a fase ou fases que conteñen o analito de interese son chamadas mostras, mentres que calquera outra cousa separada durante a análise son lixo.
• O soluto son os compoñentes de mostra na cromatografía de separación.
• O solvente é calquera substancia capaz de solubilizar outras substancias, e concretamente a fase móbil líquida na LC.
• A fase estacionaria é a substancia que se fixa para o procedemento cromatográfico. Un exemplo sería a capa de sílice na cromatografía en capa fina.

Teoría da cromatografía

Esquema dun cromatógrafo. A mestura insírese nas condicións axeitadas, e o cromatógrafo faina pasar a través da columna. Nela os compoñentes desprázanse a diferente velocidade segundo a afinidade. Na saída da columna disponse un detector que pode ser dende o ollo humano ata un espectrómetro de masas, e opcionalmente trázase o cromatograma. Tamén se pode realizar un paso final de separación, ou ben tirar os analitos ó lixo.

A cromatografía é un método de separar mesturas e identificar os seus compoñentes, e dicir, é un método de separación que aproveita a diferenza de repartición de analitos entre a fase móbil e a fase estacionaria para separar compoñentes na mostra. Os compostos dunha mestura poden interactuar coa fase estacionaria segundo a súa carga eléctrica (interaccións ión-ión, interaccións ión-dipolo), por forzas de van der Waals, pola solubilidade relativa ou adsorción (interaccións hidrofóbicas, afinidade específica). Hai dúas teorías de cromatografía, a dos pratos e a da taxa.

Retención

A retención é a medida da velocidade coa que a substancia se move no sistema cromatográfico. En sistemas de desenvolvemento continuo, como HPLC ou GC, onde os compoñentes son eluídos co eluínte, a retención mídese normalmente como tempo de retención $R_{t}$ ou $t_{R}$, o tempo entre a inxección e a detección. En sistemas de desenvolvemento interrompido como a TLC á retención mídese como factor de retención $R_{f}$, a distancia de carreira do composto dividido pola distancia de carreira do fronte do eluinte:

$R_{f}={\frac {distancia\ percorrida\ polo\ composto}{distancia\ percorrida\ polo\ solvente}}$

A retención dun compoñente a miúdo difire considerablemente entre experimentos, debido a variacións no eluinte, na fase estacionaria, temperatura, matriz da mostra e no axustes. Así vólvese importante comparar a retención do compoñente testado coa retención de varios compoñentes estándar baixo condicións absolutamente idénticas.

Durante o proceso cromatográfico o analito experimenta un expandemento como resultado da difusión. Dous analitos con tempos de retención diferentes pero cunha expansión importante non resolven ben, polo que calquera sistema cromatográfico precisa minimizar o efecto. Isto conséguese seleccionando fases móbiles e estacionarias apropiadas, axustando a velocidade do eluinte, a distancia percorrida e a temperatura. A Ecuación de van Deemter precisa unha velocidade de elución tendo en conta diversas variables.

Teoría de pratos

A teoría de pratos da cromatografía desenrolárona Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge. A teoría de pratos describe o sistema cromatográfico, coa fase estacionaria e móbil en equilibrio. O coeficiente K baséase neste equilibrio, e defínese pola seguinte ecuación:

$K={\frac {Concentracion\ de\ soluto\ na\ fase\ estacionaria}{Concentracion\ de\ soluto\ na\ fase\ mobil}}$

Suponse que K é independente da concentración, e pode variar se cambian as condicións experimentais, por exemplo se aumenta ou diminúe a temperatura. Cando K aumenta, ó soluto lévalle máis tempo separarse.

Para unha columna de lonxitude e fluxo fixo, o tempo de retención $(t_{R})$ e o volume de retención $(V_{r})$ poden medirse e utilizarse para calcular K.

Técnicas cromatográficas segundo a fase

Cromatografía en columna

Artigo principal: Cromatografía en columna.

A cromatografía en columna é unha técnica de separación na que a fase estacionaria está dentro dun tubo. As partículas da fase sólida estacionaria ou o soporte enchoupado en líquido estacionario poden ocupar todo o espazo dentro do tubo (columna empaquetada) ou estar concentradas ó longo da cara interna do tubo, deixando un camiño libre na parte media (columna de tubo aberto). Hai que calcular as diferenzas nas taxas de movemento a través do medio para diferentes tempos de retención da mostra.

En 1978, W. C. Still presentou unha versión modificada da columna cromatográfica chamada cromatografía en columna flash (flash). A técnica é moi similar á cromatografía en columna tradicional, excepto que para que o solvente se mova pola columna aplícase presión positiva. Isto permite que as separacións se leven a cabo en menos de 20 minutos, e a separación sexa máis precisa que co método estándar. Os sistemas de cromatografía flash modernos véndense como cartuchos plásticos pre-empaquetados, e o solvente bombéase a través do cartucho. Estes sistemas poden acoplarse con detectores e colectores de fraccións automatizados. A aplicación de presións en gradientes dan separacións máis rápidas e menor gasto de solventes.

Na adsorción en matriz expandida utilízase unha matriz viscosa no canto da fase sólida das matrices empaquetadas. Así evítanse os pasos de clarificación inicial como centrifugados e filtrados, especialmente axeitado para caldos de cultivo ou xeles de células.

Cromatografía planar

Cromatografía en capa fina utilizada para separar compoñentes da clorofila

A cromatografía planar é unha técnica de separación na que a fase estacionara aparece como un plano. O plano pode ser un papel, funcionando por si mesmo ou enchoupado nalgunha substancia que funcione como matriz (cromatografía en papel) ou unha capa de partículas sólidas repartidas nun suporte como podería ser unha placa de cristal (cromatografía en capa fina).

Cromatografía en papel

Artigo principal: Cromatografía en papel.

A cromatografía en papel é unha técnica na que se deposita un pequeno punto de solución de mostra nunha tira de papel cromatográfico. O papel ponse nunha xerra que contén unha capa de solvente no fondo, e sélase. Conforme o solvente sobe polo papel, chega á mostra estudada, que comeza a viaxar ó largo do papel co solvente. Os diferentes compostos químicos da mostra desprázanse diferentes distancias segundo a súa interacción co papel. Así pode calcularse un valor para $R_{f}$, e pode compararse con compoñentes estándar na identificación dun compoñente descoñecido.

Cromatografía en capa fina

Artigo principal: Cromatografía en capa fina.

A cromatografía en capa fina (TLC) é unha técnica moi estendida nos laboratorios, similar á cromatografía en papel. No canto de empregar unha fase estacionaria de papel, emprégase unha fase estacionaria dunha capa fina de adsorbente como xel de sílice, alúmina ou celulosa dispostas sobre un plano de substrato inerte. Comparada co papel ten a vantaxe de carreiras máis rápidas, mellores separacións e posibilidade de elixir varios adsorbentes. Os distintos compostos químicos da mestura viaxan máis ou menos distancia segundo a forza coa que interactúen co adsorbente. Así permítese o cálculo do valor de $R_{f}$ que pode compararse con compoñentes estándar para axudar na identificación de substancias descoñecidas.

Técnicas segundo o estado da fase móbil

Cromatografía de gases

Artigo principal: Cromatografía de gases.

A cromatografía de gases (GC), tamén chamada cromatografía líquido-gasosa (GLC) é unha técnica de separación na que a fase móbil é un gas. A cromatografía de gas sempre se realiza nunha columna, que normalmente é "empaquetada" ou "capilar".

A cromatografía de gases baséase no equilibrio de partición dun analito entre a fase sólida estacionaria (a miúdo un líquido de tipo silicona) e un móbil gasoso (aínda máis comunmente Helio). A fase estacionaria adhírese ó interior dun tubo de cristal moi fino (unha columna capilar) ou nunha matriz maior dentro dun tubo metálico (unha columna empaquetada). Aplícase con frecuencia en química analítica, xa que as altas temperaturas que se utilizan na GC fana inutilizable para proteínas e biopolímeros de alto peso molecular (desnaturalizaríanse co calor) a técnica axústase mellor ó uso con nos campos dos petroquímicos, monitorización ambiental e industria química. Tamén se utiliza en investigación química.

Cromatografía líquida

A cromatografía líquida (LC) é unha técnica de separación na que a fase móbil é líquida. A cromatografía líquida pode levarse a cabo tanto en columna como en plano. A cromatografía líquida actual que utiliza partículas moi pequenas empaquetadas e presións relativamente altas chámase cromatografía líquida de alto rendemento HPLC.

Nas técnicas de HPLC, a mostra fórzase a pasar a través dunha columna que leva empaquetadas partículas esféricas ou irregulares, ou un bloque poroso, acompañada pola fase móbil líquida a alta presión. O HPLC divídese historicamente en dúas clases baseándose na polaridade da fase móbil e da fase estacionaria. Cando a fase estacionaria é máis polar que a fase móbil (p. ex. tolueno como fase móbil e octadecilsilano como fase estacionaria) chámase cromatografía en fase líquida reversa (RPLC). A fase normal ten menos aplicación, e a RPLC aplícase en moitos máis campos.

As técnicas específicas que se aplican co estes métodos xerais lístanse máis adiante. Estas técnicas poden considerarse como cromatografía líquida rápida para proteínas se non se utiliza presión para forzar a fase móbil a través da fase estacionaria.

Cromatografía de fluído supercrítico

Artigo principal: Cromatografía de fluído supercrítico.

A cromatografía de fluído supercrítico é unha técnica de separación na que a fase móbil é un fluído que está sobre, e relativamente preto, do seu punto crítico de presión e temperatura.

Técnicas segundo o mecanismo de separación

Cromatografía de intercambio iónico

Artigo principal: Cromatografía de intercambio iónico.

A cromatografía de intercambio iónico utiliza os mecanismos de cambio iónico para separar os analitos. Normalmente faise en columnas, pero tamén pode facerse en modo plano. A cromatografía de intercambio iónico utiliza unha fase estacionaria cargada para separar compoñentes cargados, como aminoácidos, péptidos e proteínas. Nos métodos estándar a fase estacionaria é unha resina de intercambio iónico, que leva un grupo funcional que interacciona cos grupos de carga oposta dos compoñentes que serán retidos. A cromatografía de intercambio iónico utilízase amplamente na purificación de proteínas utilizando FPLC.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Artigo principal: Cromatografía de exclusión por tamaño.

A cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) tamén coñecida como cromatografía en xel permeable ou cromatografía de filtrado en xel, separa partículas segundo o seu tamaño. As moléculas máis pequenas entran no medio poroso e tardan máis tempo en saír da columna, mentres que as partículas maiores saen antes. Normalmente é unha cromatografía de baixa resolución, e resérvase para os pasos finais dunha purificación. Tamén é útil para determinar a estrutura terciaria e a estrutura cuaternaria de proteínas purificadas, especialmente porque se pode levar a cabo en condicións axeitadas de disolución.

Cromatografía de afinidade

Artigo principal: Cromatografía de afinidade.

A cromatografía de afinidade baséase en interaccións non covalentes selectivas entre un analito e moléculas específicas. É moi específica, pero non moi robusta. Emprégase a miúdo en bioquímica na purificación de proteínas asociadas a marcadores. Estas proteínas van marcadas con compostos como etiquetas his, biotina ou antíxenos, que se enlazan á fase estacionaria de forma específica. Despois da purificación, algunhas destas marcas quítanse, e obtense a proteína purificada.

Técnicas especiais

Cromatografía en fase reversa

Artigo principal: Cromatografía en fase reversa.

A cromatografía en fase reversa é un procedemento de elución empregado en cromatografía líquida na que a fase móbil é máis polar que a fase estacionaria.

Cromatografía bidimensional

Co emprego de criterios físico-químicos adicionais para separación da mestura de analitos (a mostra), auméntase a resolución e calidade da separación cromatográfica. Obtéñense entón altas especificidades na técnica de separación cromatográfica, permitindo a separación e análise de compostos indistinguibles na cromatografía unidimensional.

Na cromatografía de gases obtense a separación bidimensional acoplando unha segunda columna máis curta que a principal. O acomplamente pode realizarse con técnicas diferentes, por exemplo un choque de frío nos eluintes segundo van saíndo da columna principal en intervalos fixos, e despois volvéndoos a quentar segundo se van inxectando na segunda columna. O tempo de viaxe pola segunda columna ten que ser menor que o tempo que tardará a seguinte mostra en reinxectarse para evitar a combinación de compoñentes e explotar a capacidade de separación.

Adicionalmente pode aplicarse un espectrómetro de masas de Tempo de Vo (TOF-MS) como segunda dimensión dunha cromatografía de gas bidimensional. Os TOF-MS utilizados en cromatografía de gases poden ser curtos, xa que so hai que diferenciar nun pequeno rango de moléculas. Nesta técnica utilízase unha columna para separar analitos, seguida por detección en TOF-MS. Así poden separarse moitos máis analitos nunha soa carreira.

Cromatografía de pirólise de gases

Os compoñentes descompóñense mediante calor en compoñentes máis básicos antes de ser inxectados no sistema cromatográfico.

Cromatografía líquida rápida para proteínas

Artigo principal: Cromatografía líquida rápida para proteínas.

A cromatografía líquida rápida para proteínas (FPLC) son unha serie de técnicas utilizadas na purificación de proteínas. Moitas destas técnicas son idénticas ás empregadas na cromatografía líquida de alto rendemento.

Cromatografía a contracorrente

Artigo principal: Cromatografía a contracorrente.

A cromatografía a contracorrente (CCC) é un tipo de cromatografía líquido-líquido, onde tanto a fase estacionaria como a fase móbil son líquidas. Implica unha mestura de líquidos, permitindo que se dispoñan en capas e despois separando estas capas.