Cromatografía de afinidade

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Saltar ata a navegación Saltar á procura

A cromatografía de afinidade é un método de separar mesturas bioquímicas baseándose nunha interacción moi específica que se establece entre un antíxeno e un anticorpo, encima e substrato, receptor e ligando, ou proteína e ácido nucleico. É un tipo de técnica de laboratorio cromatográfica usada para purificar moléculas biolóxicas que forman parte dunha mestura aproveitando as propiedades moleculares. As macromoléculas biolóxicas, como encimas e outras proteínas, interaccionan con outras moléculas con alta especificidade por medio de diferentes tipos de enlaces e interaccións. Tales interaccións poden ser enlaces de hidróxeno, interaccións iónicas, pontes disulfuro, interaccións hidrofóbicas e outras. A alta selectividade da cromatografía de afinidade débese a que se permite que a molécula desexada interaccione coa fase estacionaria e se una na columna cromatográfica para ser separada do material non desexado, que non interaccionará e sairá primeiro nas elucións.[1] As moléculas que xa non se necesitan son primeiro retiradas por lavado cun tampón mentres que as proteínas desexadas se deixan baixar en presenza do solvente eluente (de alta concentración salina). Este proceso crea unha interacción competitiva entre a proteína desexada e as moléculas estacionarias inmobilizadas, que finalmente permite que as proteínas agora altamente purificadas sexan liberadas.[2]

Uso[editar | editar a fonte]

A cromatografía de afinidade pode utilizarse para purificar e concentrar unha substancia nunha mestura nunha solución tamponada, reducir a cantidade de substancias non desexadas na mestura, identificar os compoñentes biolóxicos que se unen a unha determinada substancia, ou purificar e concentrar unha solución encimática. A molécula de interese pode ser inmobilizda por medio de enlaces covalentes. Isto ocorre utilizando unha matriz insoluble como un medio cromatográfico como a celulosa ou a poliacrilamida. Cando o medio se une á proteína de interese esta queda inmobilizada.[3]

Principio[editar | editar a fonte]

En resumo, a cromatografía de afinidade aproveita as diferenzas nas forzas de interacción entre as diferentes biomoléculas nunha fase móbil e na fase estacionaria. A fase estacionaria cárgase primeiro nunha columna cunha fase móbil que contén diversas biomoléculas desde ADN a proteínas (dependendo do experimento de purificación). Entón, déixase tempo para que as dúas fases se unan. Despois vértese un tampón de lavado na columna que contiña as dúas fases. O tampón de lavado arrastra as biomoléculas que non son a diana ao afectar ás súas débiles interaccións coa fase estacionaria. As biomoléculas diana teñen moita maior afinidade pola fase estacionaria, e permanecen unidas á fase estacionaria, e non son arrastradas polo tampón de lavado. Seguidamente, déitase un tampón de elución na columna que contén as restantes moléculas diana. O tampón de elución altera as interaccións entre as biomoléculas diana unidas coa fase estacionaria en moito maior grao que co tampón lavador, o que elimina efectivamente as biomoléculas diana. Esta solución purificada contén o tampón de elución e biomoléculas diana, e denomínase elución.[4]

A fase estacionaria é normalmente unha matriz de xel, xeralmente de agarosa; unha molécula de azucre liñal procedente das algas. Para impedir a interferencia estérica ou o solapamento durante o proceso de unión da molécula diana co ligando, adhírese primeiro ás boliñas de agarosa (soporte sólido) un inhibidor que contén unha cadea hidrocarbonada. Este inhibidor con cadea hidrocarbonada adoita denominarse espazador, situado entre a boliña de agarosa e a molécula diana.[5]

Xeralmente, o punto de partida é un grupo de moléculas heteroxéneo cru dun extracto celular completo como un lisado celular, medio de crecemento ou soro sanguíneo. A molécula de interese ten que ter unha propiedade definida coñecida, que poida ser aproveitada durante o proceso de purificación de afinidade. O propio proceso pode considerarse unha captura nunha trampa, xa que a molécula diana é atrapada nunha fase ou medio estacionario sólido. As outras moléculas da fase móbil non quedan atrapadas, xa que non posúen esa propiedade. A fase estacionaria pode despois ser retirada da mestura, lavada, e a molécula diana liberada do seu atrapamento nun proceso chamado diálise. As moléculas desexadas son eluídas con substancias específicas despois de retirar por lavado as moléculas que non interaccionan. Así, isto produce un material altamente purificado. A elución altamente específica das macromoléculas desexadas da fase estacionaria é xeralmente efectuada engadindo ao tampón de elución un gradiente do mesmo tipo sobre a macromolécula e así desprazala.[6] Posiblemente o uso máis común da cromatografía de afinidade é a purificación de proteínas recombinantes. A cromatografía de afinidade é unha excelente elección para o primeiro paso na purificación dunha proteína ou ácido nucleico a partir dunha mestura crúa.

A cromatografía de afinidade pode aplicarse tamén cando descoñecemos o peso molecular, hidrofobicidade, carga etc. dunha proteína. Un exemplo desta situación dáse cando se trata de encontrar un encima cunha actividade determinada, no que se podería construír unha columna de afinidade cun ligando unido que é similar ou idéntico ao substrato de elección. O modo en que o encima desexado será eluído a partir da mestura baséase nas fortes interaccións do encima e o análogo do substrato inmobilizado, que se producirían selectivamente a través da columna de afinidade. Entón, pode realizarse a elución do encima co substrato apropiado.[6]

Equipos en columna e en lotes[editar | editar a fonte]

Columna de cromatografía
Cromatografía en lotes

A unión á fase sólida pode conseguirse usando cromatografía en columna na que o medio sólido está metido nunha columna, a mestura inicial baixa a través da columna para que se vaia asentando, bótase un tampón de lavado pola columna e o tampón de elución despois e recóllese. Estes pasos fanse xeralmente a presión ambiental. Alternativamente, pode conseguirse a unión usando un tratamento por lotes, por exemplo, engadindo a mestura inicial á fase sólida nun recipiente, mesturando, separando a fase sólida, retirando a fase líquida, lavando, recentrifugando, engadindo o tampón de elución, recentrifugando e eliminando o eluato.

Ás veces utilízase un método híbrido no que a unión se fai polo método de lotes, pero a fase sólida coa molécula diana unida é metida nunha columna e os lavados e as elucións fanse na columna.

Os ligandos usados na cromatografía de afinidade obtéñense tanto de fontes orgánicas coma inorgánicas. Exemplos de fontes biolóxicas son as proteínas séricas, lectinas e anticorpos. Fontes inorgánicas son o ácido morónico, quelatos de metais e tinguiduras de triazina.[7]

Desenvolveuse tamén un terceiro método, a absorción en leito expandido, que combina as vantaxes dos dous métodos mencionados antes. As partículas da fase sólida son situadas nunha columna onde a fase líquida é bombeada desde o fondo e sae pola parte superior. A masa das partículas asegura que a fase sólida non sae da columna coa fase líquida.

As columnas de afinidade poden ser eluídas cambiando as concentracións de sales, pH, pI, carga e forza iónica directamente ou por medio dun gradiente para resolver as partículas de interese.

Máis recentemente, desenvolvéronse equipos que empregan máis dunha columna en serie. A vantaxe comparada cos equipos dunha soa columna é que o material de resina pode cargarse completamente, xa que ningún produto non unido pasa directamente á columna seguinte co material da columna fresco. Estes procesos cromatográficos coñécense como cromatografía contracorrente periódica (PCC). Os custos da resina por cantidade de produto producido poden así ser reducidos drasticamente. Como unha columna pode sempre ser eluída e rexenerada mentres que se carga a outra columna, dúas columnas son xa suficientes para facer uso completo das vantaxes.[8] As columnas adicionais poden dar unha flexibilidade adicional para os tempos de rexeneración e a elución, pero cun custo de equipamento adicional e os custos da resina.

Usos específicos[editar | editar a fonte]

A cromatografía de afinidade pode ser utilizada en varias aplicacións, como a purifcación de ácidos nucleicos, purificación de proteínas a partir de extractos de células ou a partir do sangue.

Usando a cromatografía de afinidade, pódense separar proteínas que se unen a certos fragmentos, doutras proteínas que non se unen a ditos fragmentos.[9] Como esta técnica de purificación depende ds propiedades biolóxicas das proteínas necesarias, é unha técnica útil e as proteínas poden ser purificadas nun paso.[10]

Medios e afinidade[editar | editar a fonte]

Existen moitos medios de afinidade diferente para unha variedade de posibles usos.[11] Brevemente e en xeral, estes medios e métodos son:

  • Activado/Funcionalizado – Funciona como un espazador funcional, matriz de soporte, e elimina a necesidade de manipular reactivos tóxicos.
  • Aminoácido – Usado cunha variedade de proteínas séricas, outras proteínas, péptidos e encimas, así como ARNr e ADN bicatenario.
  • Avidina Biotina – Usado no proceso de purificación de biotina/avidina e os seus derivados.
  • Enlace a carbohidratos – As máis das veces usada con glicoproteínas ou calquera outra substancia que conteña carbohidratos.
  • Carbohidrato – Usada con lectinas, glicoproteínas, ou calquera outra proteína metabolito carbohidrato.
  • Ligando de tinguiduras – Este medio non é específico, pero imita substratos biolóxicos e proteínas.
  • Glutatión – Útil para a separación de proteínas recombinantes etiquetadas con GST (glutatión-S-transferase).
  • Heparina – Este medio é un ligando de afinidade xeneralizado, e é útil principalmente para a separación de proteínas da coagulación do plasma, xunto con ácidos nucleicos, encimas e lipases.
  • Interacción hidrofóbica – Usada principalmente cando a diana son grupos carboxilo libres e proteínas.
  • Inmunoafinidade – Detallada máis abaixo, ese método utiliza a alta especificidade de antíxenos e anticorpos para separalos.
  • Cromatografía de Afinidade de Metais Inmobilizados – Detallada máis abaixo, este método usa as interaccións entre ións metálicos e proteínas (xeralmente as que están especialmente etiquetadas) para así sepralas.
  • Nucleótido/Coencima – Funciona para separar deshidroxenases, quinases e transaminases.
  • Ácido nucleico – Funciona atrapando ARNm, ADN, ARNr e outros ácidos nucleicos/oligonucleótidos.
  • Proteína A/G – Este método é utilizado para purificar inmunoglobulinas.
  • Especialidade – Deseñada para unha clase específica ou tipo de proteína/coencima, este tipo de medio só funciona para separar unha proteína específica ou coencima.

Inmunoafinidade[editar | editar a fonte]

Outro uso é a purificación por afinidade dos anticorpos presentes no soro sanguíneo. Se o soro se sabe que contén anticorpos contra un antíxeno específico (por exemplo se o soro procede dun organismo inmunizado contra o antíxeno en cuestión) despois pode usarse para a purificación por afinidade dese antíxeno. Isto tamén se denomina cromatografía de inmunoafinidade. Por exemplo, se un organismo está inmunizado contra a proteína de fusión-GST producirá anticorpos contra a proteína de fusión, e posiblemente anticorpos contra a etiqueta GST (glutatión-S-transferase) tamén. A proteína pode despois ser acoplada covalentemente a un soporte sólido como a agarosa e utilizado como un ligando de afinidadde na purificación de anticorpos do soro inmune.

Para unha maior exhaustividade a proteína GST e a proteína de fusión-GST poden ambas ser acopladas por separado. Ao soro déixaselle inicialmente unirse á matriz de afinidade GST. Isto eliminará os anticorpos contra a parte GST da proteína de fusión. O soro é despois separado do soporte sólido e se lle deixa unirse á matriz da proteína de fusión-GST. Isto permite que todo o anticorpo que recoñeza o antíxeno sexa capturado no soporte sólido. A elución dos anticorpos de interese adoita conseguirse usando un tampón de pH baixo como o de glicina a pH 2,8. O eluato é recollido nun tris neutro ou tampón fosfato, para neutralizar o tampón de elución de pH baixo e deter calquera degradación da actividade do anticorpo. Este é un fermoso exemplo, xa que a purificación de afinidade se utiliza para purificar a proteína de fusión-GST inicial, de como eliminar os anticorpos anti-GST non desexados do soro e purificar o anticorpo diana.

Os anticorpos monoclonais poden tamén ser seleccionados para unirse a proteínas con grande especificidade, e desenvolvéronse métodos par que a proteína sexa liberada en condicións bastante suaves.[12]

Unha estratexia simplificada emprégase a miúdo para purificar anticorpos xerados contra antíxenos peptídicos. Cando os antíxenos peptídicos se producen sinteticamente, un residuo de cisteína terminal é engadido a cada un dos extremos N-terminal e C-terminal do péptido. Este residuo de cisteína contén un grupo funcional sulfhidrilo, que permite que o péptido sexa doadamente conxugado a unha proteína portadora (por exemplo, a KLH ou Keyhole limpet hemocyanin, hemocianina de fisurélidos). O mesmo péptido que contén cisteína é tamén inmobilizado en resina de agarosa por medio dun residuo de cisteína e é despois utilizado para purificar o anticorpo.

A maioría dos anticorpos monoclonais foron purificados usando a cromatografía de afinidade baseándose na proteína A ou na proteína G específicas de inmunoglobulina, derivadas de bacterias.[13]

Cromatografía de afinidade de ións metálicos inmobilizados[editar | editar a fonte]

A cromatografía de afinidade de ión metálico inmobilizado (IMAC) está baseada no enlace covalente coordinado específico entre metas e aminoácidos, especialmente a histidina. Este técnica funciona facendo que as proteínas cunha afinidade polos ións metálicos sexan retidas nunha columna que contén os ións metálicos inmobilizados, como os de cobalto, níquel, cobre (para a purificación de péptidos ou proteínas que conteñen histidina), ferro, zinc ou galio (para a purificación de péptidos ou proteínas fosforiladas). Moitas proteínas que aparecen na natureza non teñen unha afinidade polos metais iónicos, por tanto, a tecnoloxía do ADN recombinante pode utilizarse para introducir esa etiqueta proteica no xene relevante. Os métodos utilizados usados para eluír a proteína de interese inclúen cambiar o pH, ou engadir unha molécula competitiva, como o imidazol.

Unha columna de cromatografía que contén boliñas de níquel-agarosa usada para a purificación de proteínas con etiqetas de histidina.
Véxase tamén: Etiqueta de polihistidina.

Proteínas recombinantes[editar | editar a fonte]

Posiblemente o uso máis habitual da cromatografía de afinidade é para a purificación de proteínas recombinantes. As proteínas cunha afinidade coñecida son etiquetadas con proteínas (engádenselle unhas secuencias de péptidos) para axudar á súa purificación. A proteína pode ser xeneticamente modificada para permitir que sexa seleccionada pola unión da afinidade; isto coñécese como proteína de fusión. Entre as etiquetas están a glutatión-S-transferase (GST), hexahistidina (His), e a proteína de unión á maltosa (MBP). As etiquetas de histidina teñen unha afinidade polos ións níquel ou cobalto, que foron inmobilizados pola formación de enlaces covalentes coordinados cun quelador incorporado na fase estacionaria. Para a elución úsase unha cantidade en exceso dun composto con capacidade de actuar como un ligando de ión metálico, como o imidazol. O GST ten unha afinidade polo glutatión, o cal é dispoñible comercialmente inmobilizado como glutatión agarosa. Durante a elución, utilízase un exceso de glutatión para desprazar a proteína etiquetada.

Lectinas[editar | editar a fonte]

A cromatografía de afinidade de lectinas é unha forma de cromatografía de afinidade no que as lectinas se utilizan para separar compoñentes dentro dunha mostra. As lectinas, como a concanavalina A son proteínas que poden unirse especificacmente a moléculas de carbohidrato como a alfa-D-manosa e á alfa-D-glicosa. Outro exemplo de lectina é a aglutinina do xerme de trigo, que se une á D-N-acetilglicosamina.[14] A aplicación máis común é separar as glicoproteínas das proteínas non glicosiladas, ou unha glicoforma doutra glicoforma.[15]

Especialidade[editar | editar a fonte]

Outro uso da cromatografía de afinidade é a purificación de proteínas específicas usando unha matriz de xel que é única para unha proteína específica. Por exemplo, a purificación da β-galactosidase de E. coli realízase por cromatografía de afinidade usando p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa como matriz de afinidade. Utilízase a p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa utilízase porque contén un grupo galactopiranosil, que serve como un bo análogo de substrato para a β-galactosidase de E. coli. Esta propiedade permite que o encima se una á fase estacionaria da matriz de afinidade e sexa eluída engadindo concentracións crecentes de sales á columna.[16]

A cromatografía de afinidade de boronato consiste no uso de ácido borónico ou boronatos para eluír e cuantificar cantidades de glicoproteínas. As adaptacións clínicas aplicaron este tipo de cromatografía para realizar unha avaliación a longo prazo dos pacients diabéticos por medio da análise da súa glicohemoglobina.[14]

Purificación da seroalbumina[editar | editar a fonte]

Dos moitos usos da cromatografía de afinidade, un uso é a purificación de afinidade da seroalbumina e a contaminación por macroglobulina. Este tipo de purificación é útil para eliminar o exceso de seroalbumina e contaminación por α2-macroglobulina, cando se realiza unha especrtrometría de masas. Na purificación de afinidade da seroalbumina, o estacionario usado para recoller ou atraer proeínas séricas pode ser a Cibacron Blue-Sefarosa. Despois as proteínas séricas poden se eluídas a partir do adsorbente cun tampón que conteña tiocianato (SCN).[17]

Cromatografía de afinidade débil[editar | editar a fonte]

A cromatografía de afinidade débil[18] (WAC, do inglés weak affinity chromatography) é unha técnica de cromatografía de afinidade para os exames de afinidade no desenvolvemento de fármacos.[19][20] A WAC é unha técnica de cromatografía líquida baseada na afinidade, que separa compostos quimicos aproveitando as súas diferentes afinidades débiles a unha etiqueta inmobilizada. Canta maior afinidade teña un composto cara á etiqueta, máis tempo permanecerá na unidade de separación, e isto será expresado como un tempo de retención máis longo. A medida da afinidade e escala de afinidade poden obterse procesando os tempos de retención obtidos dos compostos analizados.

A tecnoloxía WAC demostrouse válida contra varias dianas de proteínas, como dianas de proteases, quinases, chaperonas e de interaccións proteína-proteína. A WAC é máis efectiva que os métodos establecidos para o exame baseado en fragmentos.[20]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. Ninfa, Alexander J.; Ballou, David P.; Benore, Marilee (2009). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology (2 ed.). Wiley. p. 133. ISBN 9780470087664. 
  2. Ninfa; Ballou; Benroe, Alexander, J; David P; Marilee. Fundamental Approaches to Biochemistry and Biotechnology. John Wiley & Sons. 
  3. H., Garrett, Reginald (2013). Biochemistry. Grisham, Charles M. (5th ed.). Belmont, CA: Brooks/Cole, Cengage Learning. ISBN 9781133106296. OCLC 777722371. 
  4. Fujita-Yamaguchi, Yoko (2015). "Affinity Chromatography of Native and Recombinant Proteins from Receptors for Insulin and IGF-I to Recombinant Single Chain Antibodies". Frontiers in Endocrinology (en English) 6. ISSN 1664-2392. doi:10.3389/fendo.2015.00166. 
  5. Cuatrecasas, Pedro (June 25, 1970). "Protein Purification by Affinity Chromatography" (PDF). JBC. Consultado o November 22, 2017. 
  6. 6,0 6,1 J., Ninfa, Alexander (2010). Fundamental laboratory approaches for biochemistry and biotechnology. Ballou, David P., Benore, Marilee. (2nd ed.). Hoboken, NJ: John Wiley. ISBN 9780470087664. OCLC 420027217. 
  7. Fanali, Salvatore, Haddad, Paul R., and Poole, Coli (2013). Handbooks in Separation Science : Liquid Chromatography : Applications. Saint Louis: US: Elsevier. p. 3. 
  8. Baur, Daniel; Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Steinebach, Fabian; Morbidelli, Massimo (2016). "Comparison of batch and continuous multi-column protein A capture processes by optimal design". Biotechnology Journal (John Wiley & Sons, Inc.) 11 (7): 920–931. doi:10.1002/biot.201500481. Consultado o 16 August 2016. 
  9. Ahern, Kevin (February 12, 2015). Biochemistry Free & Easy. DaVinci Press; 3rd Edition edition. p. 822. 
  10. M., Grisham, Charles (2013-01-01). Biochemistry. Brooks/Cole, Cengage Learning. ISBN 1133106293. OCLC 777722371. 
  11. "Affinity Chromatography". 
  12. Thompson, Nancy E.; Foley, Katherine M.; Stalder, Elizabeth S.; Burgess, Richard R. Chapter 28 Identification, Production, and Use of Polyol-Responsive Monoclonal Antibodies for Immunoaffinity Chromatography (en inglés). pp. 475–494. doi:10.1016/s0076-6879(09)63028-7. 
  13. Uhlén M (2008). "Affinity as a tool in life science.". Biotechniques 44 (5): 649–54. PMID 18474040. doi:10.2144/000112803. 
  14. 14,0 14,1 Hage, David (May 1999). "Affinity Chromatography: A Review of Clinical Applications" (PDF). Clinical Chemistry 45 (5): 593–615. 
  15. "GE Healthcare Life Sciences, Immobilized lectin". Arquivado dende o orixinal o 03 de marzo de 2012. Consultado o 01 de abril de 2018. 
  16. Ninfa, Alexander J.; Ballou, David P.; Benore, Marilee (2006). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology (2 ed.). Wiley. p. 153.
  17. Naval, Javier; Calvo, Miguel; Lampreave, Fermin; Piñeiro, Andrés (1983-01-01). "Affinity chromatography of serum albumin: An illustrative laboratory experiment on biomolecular interactions". Biochemical Education (en inglés) 11 (1): 5–8. ISSN 1879-1468. doi:10.1016/0307-4412(83)90004-3. 
  18. Zopf, D.; S. Ohlson (1990). "Weak-affinity chromatography". Nature 346 (6279): 87–88. Bibcode:1990Natur.346...87Z. ISSN 0028-0836. doi:10.1038/346087a0. 
  19. Duong-Thi, M. D.; Meiby, E.; Bergström, M.; Fex, T.; Isaksson, R.; Ohlson, S. (2011). "Weak affinity chromatography as a new approach for fragment screening in drug discovery". Analytical Biochemistry 414 (1): 138–146. PMID 21352794. doi:10.1016/j.ab.2011.02.022. 
  20. 20,0 20,1 Meiby, E.; Simmonite, H.; Le Strat, L.; Davis, B.; Matassova, N.; Moore, J. D.; Mrosek, M.; Murray, J.; Hubbard, R. E.; Ohlson, S. (2013). "Fragment Screening by Weak Affinity Chromatography: Comparison with Established Techniques for Screening against HSP90". Analytical Chemistry 85 (14): 6756–6766. PMID 23806099. doi:10.1021/ac400715t. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas[editar | editar a fonte]