Eastern blot

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Saltar para a navegação Saltar para a pesquisa

O eastern blot é unha técnica bioquímica de blotting utilizada para analizar modificacións postraducionais de proteínas como as que implican lípidos, residuos fosfóricos e glicoconxugados. Na maior parte dos casos utilízase para detectar epítopos de carbohidratos na proteína. Deste modo, o eastern blot pode considerarse unha ampliación da técnica bioquímica do western blot. Téñense descrito moitas técnicas usando o termo eastern blot ou eastern blotting, a maioría dos cales usan proteínas que se transfiren desde un xel de SDS-PAGE a unha membrana de PVDF ou nitrocelulosa. As proteínas transferidas son analizadas para detectar as súas modificacións postraducionais utilizando sondas que poden detectar lípidos, carbohidratos, fosforilacións ou calquera outra modificación da proteína. O termo eastern blot debería utilizarse para referirse aos métodos que detectan as súas dianas por medio de interaccións específicas entre a modificación postraducional e a sonda, para distinguila do far-western blot estándar. En principio, o eastern blot é similar ao blotting de lectina (é dicir, a detección de epítopos de carbohidratos sobre proteínas ou lípidos).[1] De todos modos, non hai unha definición universalmente aceptada desta técnica na literatura, como se resume no seguinte capítulo.

Historía e múltiples definicións[editar | editar a fonte]

A definición precisa do termo eastern blot ou eastern blotting (moitas veces Eastern aparece con maiúscula) é algo confusa debido a que varios autores bautizaron novos métodos como Eastern blotting ou un derivado del. Todas as definicións refírense a métodos que derivan da técnica do western blotting desenvolvida por Towbin en 1979.[2] As actuais definicións están resumidas a continuación ordenadas desde o primeiro uso do termo; porén, todas están baseadas nalgúns traballos iniciais. Nalgúns casos, a técnica estivera utilizándose xa antes da introdución do termo.

  • (1982) O termo Eastern blotting foi rexeitado especificamente por dous grupos separados: Reinhart e Malamud refírense a un blot de proteínas dun xel nativo como native blot (blot nativo);[3] Peferoen et al., optaron por referirse ao seu método de arrastrar proteínas separadas en xel SDS a nitrocelulosa usando unha bomba de succión como vacuum blotting (~blotting de baleiro ou de aspiración).[4][5]
  • (1984) Descríbese o termo Middle Eastern blotting como un blot de ARN poliA (resolvido en agarosa) que despois é inmobilizado. O ARN inmobilizado é despois sondado con ADN.[6]
  • (1996) Bogdanov et al. son os que usan por primeira vez o termo Eastern-Western blot.[7] O método implicaba a transferencia (blotting) de fosfolípidos a unha membrana de PVDF ou nitrocelulosa antes de transferir as proteínas á mesma membrana de nitrocelulosa por medio dun western blot convencional e sondar con anticorpos específicos de conformación. Este método está baseado nos traballos previos de Taki et al. de 1994, nos que eles denominaban orixinalmente a técnica como TLC blotting,[8] e estaba baseado nun método similar introducido por Towbin en 1984.[9]
  • (2001) Eastern blotting é descrita como unha técnica para detectar glicoconxugados xerados por transferencia de BSA en membranas de PVDF, seguida dun tratamento con periodato. A proteína oxidada é despois tratada cunha mestura complexa, xerando un novo conxugado na membrana. A membrana é despois sondada con anticorpos para buscar os epítopos de interese.[10] Este método foi tamén discutido en traballos posteriores por este grupo.[11][12] O método é esencialmente o Far-Eastern blotting.[13]
  • (2002) Eastern blot tamén se utilizou para describir un inmunoblot realizado sobre proteínas transferidas a unha membrana de PVDF desde un xel PAGE corrido con polaridade oposta.[14] Como este é esencialmente un western blot, a carga inversa qeu se utiliza serviu para bautizar a este método como eastern blot.[15][16]
  • (2005) Eastern blot foi utilizado para describir un blot de proteínas sobre membranas de PVDF no que a sonda é un aptámero en vez dun anticorpo.[17] Isto podería considerarse similar a un Southern blot, a pesar de que a interacción é entre unha molécula de ADN (o aptámero) e unha proteína, en vez de entre dúas moléculas de ADN.[18] O método é similar ao south-western blotting.
  • (2006) Eastern blotting foi utilizado para referirse á detección de proteínas de fuisión por medio de complementación. O nome está baseado no uso dun activador de encimas como parte da detección.[19][20][21]
  • (2009) Eastern blotting foi máis recentemente rebautizado por Thomas et al. como unha técnica que sonda proteínas transferidas a unha membrana de PVDF con lectinas, toxina colérica e tinguiduras químicas para detectar proteínas glicosiladas, lipoiladas ou fosforiladas.[13] Estes autores distinguen o método do Far-Eastern blot nomeado por Taki et al.[22] porque usa sondas de lectina e outros reactivos de tinguidura.
  • (2009) Eastern blot foi utilizado para describir un blot de proteínas sobre membrana de nitrocelulosa no que a sonda é un aptámero en vez dun anticorpo.[23] O método ésimilar ao south-western blotting.
  • (2011) Un estudo recente utiliza o termo Eastern blotting para describir a detección de glicoproteínas con lectinas como a concanavalina A [24]

Como se ve, está claro que non hai unha soa definición aceptada do termo. Un recente artigo[25] contén unha entrevista a Edwin Southern, creador do Southern blot, e trata sobre a rebautización de Eastern blotting a partir de Tanaka et al.[11] O artigo equipara o Eastern blot ás "fadas, unicornios, e unha comida gratuíta" e afirma que os Eastern blots "non existen". O Eastern blot é mencionado nun libro de texto de inmunoloxía, que compara os métodos de blotting comúns (Southern, northern, e western), e afirma que "porén, o Eastern blot, existe só en preguntas de tests".[26]

Os principios utilizados polo eastern blotting para detectar glicanos poden remontarse ao uso de lectinas para detectar a glicosilación de proteínas. Os exemplos máis temperáns deste modo de detección son uns traballos de Tanner e Anstee de 1976, nos que se usaban lectinas para detectar proteínas glicosiladas illadas de eritrocitos humanos.[27] A detección específica da glicosilación por medio do blotting denomínase xeralmente blotting de lectinas (lectin blotting). Un resumo de melloras máis recentes do protocolo foi elaborado por H. Freeze.[1]

Aplicacións[editar | editar a fonte]

Unha aplicación desta técnica inclúe a detección de modificacións de proteínas en dúas especies bacterianas do xénero Ehrlichia, E. muris ed IOE (Ixodes ovatus ehrlichia ou ehrlichia de Ixodes ovatus). Para detectar as modificacións de proeínas utilizáronse a subunidade B da toxina colérica (que se une a gangliósidos), a concanavalina A (que detecta glicanos que conteñen manosa) e o verde de nitrofosfo molibdato-metil (que detecta fosfoproteínas). A técnica mostra que as proteínas antixénicas de E. muris non virulentas son máis modificadas postraducionalmente que nas moi virulentas IOE.[13]

Importancia[editar | editar a fonte]

A maioría das proteínas que son traducidas a partir dos ARNm sofren modificacións antes de ser finalmente funcionais nas células. Estas modificacións denomínase modificacións postraducionais (PTMs). As proteínas pregadas nacentes, que son estables en condicións fisiolóxicas, están despois suxeitas a unha batería de modificacións catalizadas por encimas específicas nas cadeas laterais ou na cadea central da proteína.

Entre as modificacións postraducionais das proteínas están as seguintes: acetilación, acilación (miristoilación, palmitoilación), alquilación, arxinilación, ADP-ribosilación, biotinilación, formilación, xeranilxeranilación, glutamilación, glicosilación, glicilación, hidroxilación, isoprenilación, lipoilación, metilación, nitroalquilación, fosfopanteteinilación, fosforilación, prenilación, selenación, S-nitrosilación, succinilación, sulfatación, transglutaminación e ubiquitinación (sumoilación, neddylación).[28][29]

As modificacións postraducionais que ocorren no extremo N-terminal da cadea de aminoácidos xogan un importante papel na translocación a través das membranas biolóxicas. Entre as proteínas afectadas están proteínas secretoras de procariotas e eucariotas e tamén proteínas que se deben incorporar a varias membranas celulares e de orgánulos como as dos lisosomas, cloroplastos, mitocondrias e membrana plasmática. A expresión de proteínas con modificacións postraducionais é importante en varias doenzas.

Notas[editar | editar a fonte]

  1. 1,0 1,1 Freeze, HH (1993). "Preparation and analysis of glycoconjugates". Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 17: 17.7.1–17.7.8. PMID 18265163. doi:10.1002/0471142727.mb1707s23. 
  2. Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". PNAS 76 (9): 4350–4. PMC 411572. PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. 
  3. Reinhart and Malamud; Malamud, D (1982). "Protein transfer from isoelectric focusing gels: the native blot". Analytical Biochemistry 145 (2): 229–235. PMID 6181706. doi:10.1016/0003-2697(82)90439-0. 
  4. Peferoen; et al. (1982). "Vacuum-blotting: a new simple and efficient transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose". FEBS Letters 145: 369–372. doi:10.1016/0014-5793(82)80202-0. 
  5. Rocco, R.M., ed. (2005). Landmark papers in Clinical Chemistry. p. 385. ISBN 978-0-444-51950-4. 
  6. Wreschner, D.H and Herzberg, M. (1984). "A new blotting medium for the simple isolation and identification of highly resolved messenger RNA". Nucleic Acids Research 12 (3): 1349–1359. PMC 318581. PMID 6701087. doi:10.1093/nar/12.3.1349. 
  7. Bogdanov; Sun, J; Kaback, HR; Dowhan, W; et al. (1996). "A Phospholipid Acts as a Chaperone in Assembly of a Membrane Transport Protein". Journal of Biological Chemistry 271 (20): 11615–11618. PMID 8662750. doi:10.1074/jbc.271.20.11615. 
  8. Taki; Handa, S; Ishikawa, D; et al. (1994). "Blotting of glycolipids and phospholipids from a high-performance thin-layer chromatogram to a polyvinylidene difluoride membrane". Analytical Biochemistry 221 (2): 312–316. PMID 7810872. doi:10.1006/abio.1994.1418. 
  9. Towbin; Schoenenberger, C; Ball, R; Braun, DG; Rosenfelder, G; et al. (1984). "Glycosphingolipid-blotting: an immunological detection procedure after separation by thin layer chromatography". Journal of Immunological Methods 72 (2): 471–9. PMID 6381603. doi:10.1016/0022-1759(84)90015-2. 
  10. Shan; Tanaka, H; Shoyama, Y; et al. (2001). "Enzyme-linked immunosorbent assay for glycyrrhizin using anti-glycyrrhizin monoclonal antibody and a new Eastern blotting for glucuronides of glycyrrhetinic acid". Analytical Chemistry 73 (24): 5784–90. PMID 11791545. doi:10.1021/ac0106997. 
  11. 11,0 11,1 Tanaka; Fukuda, N; Shoyama, Y; et al. (2009). "Antigenic protein modifications in Ehrlichia". Journal of Agricultural and Food Chemistry 31 (10): 296–303. PMID 17455950. doi:10.1021/jf063457m. 
  12. Fukuda; Shan, Shaojie; Tanaka, Hiroyuki; Shoyama, Yukihiro; et al. (2006). "New staining methodology: Eastern blotting for glycosides in the field of Kampo medicines". Journal of Natural Medicines 60: 21–27. doi:10.1007/s11418-005-0005-3. 
  13. 13,0 13,1 13,2 Thomas; Thirumalapura, N; Crossley, EC; Ismail, N; Walker, DH; et al. (2009). "Antigenic protein modifications in Ehrlichia". Parasite Immunology 31 (6): 296–303. PMC 2731653. PMID 19493209. doi:10.1111/j.1365-3024.2009.01099.x. 
  14. Buxbaum; et al. (2002). "Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins". Analytical Biochemistry 314 (1): 70–76. PMID 12633604. doi:10.1016/S0003-2697(02)00639-5. 
  15. Kurien & Scofield; Scofield, RH (2006). "Western Blotting". Methods 38 (4): 283–293. PMID 16483794. doi:10.1016/j.ymeth.2005.11.007. 
  16. Buxbaum (2009). "Cationic electrophoresis and Eastern blotting". Methods in Molecular Biology 536: 115–128. PMID 19378051. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_14. 
  17. Leca-Bouvier & Blum; Blum, Loïc (2005). "Biosensors for protein detection: A review". Analytical Letters 38: 1491. doi:10.1081/AL-200065780. 
  18. Jayasena (1999). "Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics". Clinical Chemistry 45 (9): 1628–1650. PMID 10471678. 
  19. Horecka; Charter, NW; Bosano, BL; Fung, P; Kobel, P; Peng, K; Eglen, RM; et al. (2006). "A novel antibody-free method for protein blotting using enzyme fragment complementation". Biotechniques 40 (3): 381–383. PMID 16568826. doi:10.2144/000112119. 
  20. Olson and Eglen; Eglen, RM (2007). "beta Galactosidase complementation: A cell-based luminescent assay platform for drug discovery". ASSAY and Drug Development Technologies 5 (1): 137–144. PMID 17355206. doi:10.1089/adt.2006.052. 
  21. Commercially available Eastern Blot kits
  22. Ishikawa & Taki; Taki, T (2000). "Thin-layer chromatography blotting using polyvinylidene difluoride membrane (Far eastern blotting) and its applications.". Methods in Enzymology 312: 145–57. doi:10.1016/S0076-6879(00)12905-2. PMID 11070868.
  23. Lin & McNatty; Lin, JS (2009). "Aptamer-Based Regionally Protected PCR for Protein Detection". Clinical Chemistry 55 (9): 1687–1693. PMID 19589846. doi:10.1373/clinchem.2009.127266. 
  24. Mariappa D, Sauert K, Mariño K, Turnock D, Webster R, van Aalten DM, Ferguson MA, Müller HA. Protein O-GlcNAcylation is required for fibroblast growth factor signaling in Drosophila.Sci Signal. 2011 Dec 20;4(204) ra89.http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/pdf/nesthocker.pdf
  25. http://www.rsc.org/chemistryworld/News/2007/May/04050701.asp
  26. Luttman, Bratke and Kupper (2006). Immunology. Academic Press. p. 11. ISBN 978-0-12-088544-2. 
  27. Tanner, MJ and Anstee, DJ (1976). "A method for the direct demonstration of the lectin-binding components of the human erythrocyte membrane". Biochemistry Journal 153 (2): 265–270. PMC 1172571. PMID 1275889. 
  28. Mann, M; Jensen, ON (2003). "Proteomic analysis of post-translational modifications". Nature Biotechnology 21 (3): 255–261. PMID 12610572. doi:10.1038/nbt0303-255. 
  29. Walsh, CT; Garneau-Tsodikova, S; Gatto, GJ Jr (2005). "Protein posttranslational modifications: The chemistry of proteome diversifications". Angewandte Chemie International Edition in English 44: 7342–7372. PMID 16267872. doi:10.1002/anie.200501023. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]