Northwestern blot

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Saltar ata a navegación Saltar á procura

O northwestern blot, tamén chamado ensaio northwestern, é unha técnica analítica de bioloxía molecular híbrida entre o western blot e o northern blot, que se utiliza para detectar as interaccións entre o ARN e as proteínas. A técnica relacionada do western blot utilízase para detectar proteínas de interese realizando unha transferencia a unha membrana de nitrocelulosa de ditas proteínas, que son separadas previamente por electroforese en xel. Os grupos de precipitados coloreados ao longo das bandas que quedan sobre a membrana conteñen unha determinada proteína diana. O northern blot é unha técnica similar que, en vez de detectar unha proteína de interese, úsase para estudar a expresión xénica pola detección de ARN (ou ARNm illado) sobre unha membrana similar á do wastern blot. Pola súa parte, o northwestern blot combina as dúas técnicas, e implica especificamente a identificación de ARN etiquetado que interacciona con proteínas que son inmobilizadas nunha membrana de nitrocelulosa similar. Serve para separar proteínas que interaccionan co ARN.

Historia[editar | editar a fonte]

O científico Edwin Southern foi o creador da primeira técnica de blotting ou transferencia, que se denominou co seu apelido Southern blot (transferencia de Southern),[1] que era unha técnica analítica utilizada para detectar ADN. A técnica requiría usar electroforese en xel, un importante método analítico que implica a migración de ADN, ARN ou proteínas cargados a través dun campo eléctrico, que se separan baseándose no seu tamaño e carga.[2] No Southern blot, os fragmentos de ADN separados son despois transferidos a unha membrana de filtración para a detección.[1] Detéctanse como bandas que se fan visibles na membrana e correlaciónanse cunha determinada molécula de interese.[2] Posteriormente, apareceron outras técnicas de blotting que se nomearon facendo un xogo de palabras co apelido Southern e os nomes dos puntos cardinais en inglés, que servían par detectar outras moléculas ou as interaccións entre moléculas. Entre elas están o western blot (para detección de proteínas), o northern blot (detección de ARN), o southwestern blot (detección da interacción ADN-proteína), o eastern blot (detección de modificacións postraducionais) e a northwestern blot (detección de interacción ARN-proteína). Estas técnicas escríbense con frecuencia con maiúscula, facendo unha analoxía co Southern blot.[3][4][5][6]

Especificidades da técnica[editar | editar a fonte]

Realizar un northwestern blot implica separar as proteínas que se unen ao ARN por medio de electroforese en xel, que as sepra bseándose no seu tamaño e carga. Cada mostra debe cargarse nos pozos dun xel de agarosa ou poliacrilamida (xeralmente para facer unha SDS-PAGE) para analizar múltiples mostras ao mesmo tempo.[5] Unha vez que se completou a electroforese en xel, o xel e as proteínas que se unen ao ARN asociadas son transferidas a un papel ou lámina de nitrocelulosa.[7]

Os blots acabados de transferir son despois mergullados nunha solución bloqueante; tampóns bloqueantes comúns son o leite desnatado e a seroalbumina bovina.[8] Esta solución bloqueante axuda a impedir que se produzan unións non específicas cos anticorpos primarios ou secundarios da membrana de nitrocelulosa. Unha vez que se deixou que a solución bloqueante tivese un tempo adecuado de contacto co blot, aplícase un ARN competidor específico e déixase tempo para que incube á temperatura dunha habitación. Durante este tempo, o ARN competidor únese ás proteínas que se unen ao ARN nas mostras do blot. O tempo de incubación durante este proceso pode variar dependendo da concentración do ARN competidor aplicado, pero adoita ser de unha hora.[9] Despois de completada a incubación, o blot adoita lavarse polo menos tres veces durante 5 minutos en cada lavado, para diluír e retirar o ARN da solución. Tampóns de lavado comúns son o salino tamponado con fosfato (PBS) ou unha solución ao 10% de Tween 20.[10] Un lavado incorrecto afecta á claridade do revelado do blot. Unha vez rematado o lavado, o blot revélase despois con raios X ou métodos similares de autorradiografía.[11]

Aplicacións[editar | editar a fonte]

Despois de revelar o blot usando raios X ou autorradiografía, os resultados poden anlizarse e interpretarse para determinar o tamaño proximado e concentración das proteínas de interese que se unen o ARN para realizar un posterior estudo das mesmas. A localización e concentración das proteínas que se unen ao ARN no blot poden afectar os resultados, e por veces poden aparecer bandas despois do revelado. Estas bandas poden axudar aos investigadores a determinr o tamaño e a concentración das proteínas que se unen ao ARN de interese.[12] Cando se coñece o tamaño aproximado da proteína, a mostra orixinal pode facerse pasar por unha máquina de cromatografía para separala por tamaño.[13] Ademais, unha vez que se illa a proteína, pode dixerirse con tripsina, e pode utilizarse a espectrometría de masas para secuenciar os péptidos e determinar a identidade da proteína específica.[14]

Vantaxes e desvantaxes[editar | editar a fonte]

Entre as vantaxes que teñen os northwestern blots están a detección rápida de proteínas específicas que se unen ao ARN e a estimación dos pesos moleculares aproximados de ditas proteínas.[15] O northwestern blot permite a detección de proteínas identificadas de forma barata. O blot é normalmente o primeiro paso que se realiza nunha investigación, xa que permite a identificación dos pesos moleculares aproximados, e unha vez que se coñece o peso molecular permite posteriores investigacións ou purificacións usando outros métodos como a cromatografía. Outra vantaxe do northwestern blot é que axuda a construír bibliotecas de expresión de ligandos cognados.[16]

Unha desvantaxe que se ten sinalado é que algunhas interaccións ARN-proteína con propiedades de unión ao ARN malas poden non ser detectables con esta técnica.[15] Ademais, o procedemento do blotting pode tardar de 3 a 5 horas. Se o procedemento non se fai correctamente pode causar un significativo fondo que pode orixinar un blot pouco claro das proteínas identificadas. Adicionalmente, as proteínas necesitan renaturalizrse antes de ser separadas e transferidas á membrana de nitrocelulosa. Unha última desvantaxe é que as proteínas deben constar dun só polipéptido ou de dúas subunidades que comigran na matriz do xel.[17]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. 1,0 1,1 Southern, Edwin Mellor (5 November 1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology 98 (3): 503–517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. 
  2. 2,0 2,1 Nelson, Cox (2013). Lehninger Principles of Biochemistry. New York, NY: W.H. Freeman and Company. p. 179. ISBN 978-1-4641-0962-1. 
  3. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.
  4. Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277-279.
  5. 5,0 5,1 Rapley, R (2000). The Nucleic Acid Protocols Handbook. Totowa, NJ: Humana Press Inc. p. 783. ISBN 0-89603-459-3. 
  6. Nicholas; Nelson (2013). "North, South, or East? Blotting Techniques". Journal of Investigative Dermatology 133 (e10): e10. doi:10.1038/jid.2013.216. 
  7. Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). "Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA" (PDF). Nucleic Acids Research 25 (12): 2417–2423. PMC 146745. PMID 9171094. doi:10.1093/nar/25.12.2417. Consultado o 7 May 2014. 
  8. Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (July 21, 1998). "Activities of adenovirus virus-associated RNAs: Purification and characterization of RNA binding proteins". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95 (15): 8514. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. PMC 21107. PMID 9671709. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. Consultado o 23 April 2014. 
  9. C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). "Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot". Methods of Molecular Biology. Methods in Molecular Biology 536: 441–9. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. 
  10. Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). "Spnr, a Murine RNA-binding Protein That Is Localized to Cytoplasmic Microtubules" (PDF). The Journal of Cell Biology 129 (4): 1023–1032. PMC 2120489. PMID 7744952. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. Consultado o 7 May 2014. 
  11. Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). "Specific interaction between coronavirus leader RNA and nucleocapsid protein" (PDF). Journal of Virology. 11 62 (11): 4288. Consultado o 25 March 2014. 
  12. Thangasamy, Saminathan. "Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles". Consultado o 26 March 2014. 
  13. Perdew, Gary (Aug 17, 2008). Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281. 
  14. Gary H. Perdew; Jack P. Vanden Heuvel; Jeffrey M. Peters (2008). Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281. 
  15. 15,0 15,1 Smith, Christopher W.J. (1998). RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach. Oxford University Press. p. 187. ISBN 9780191591624. 
  16. Waldo, Cohen (Aug 16, 1991). Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press. p. 186. ISBN 9780080863290. 
  17. Nicholson, Allen W. (2001). Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action. Academic Press. p. 409. ISBN 9780080496917. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas[editar | editar a fonte]

Protocolos