Blotting

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Transferencia das moléculas desde o xel de electroforese á membrana.

O blotting (transferencia) ou blot en bioloxía molecular e xenética é un método de laboratorio para transferir proteínas, ADN ou ARN a unha superficie portadora, xeralmente unha membrana de nitrocelulosa, PVDF ou nailon). En moitos casos, isto faise despois de realizar unha electroforese en xel, no que se separan as moléculas e despois transfírense desde o xel á membrana de transferencia ou blotting, pero outras veces engádense as mostras directamente sobre a membrana (como no dot blot). Despois de realizado o blotting, as proteínas, ADN ou ARN transferidos son visualizados por unha tinguidura cun colorante (por exemplo, unha tinguidura de prata das proteínas), ou por visualización autorradiográfica de moléculas marcadas radioactivamente (a marcaxe faise antes do blot), ou por un etiquetado específico dalgunhas proteínas ou ácidos nucleicos. Isto último faise con anticorpos ou sondas de hibridación que se unen soamente a algunhas moléculas do blot e teñen un encima unido a elas. Despois de realizar un lavado apropiado, esta actividade encimática (e así, a presenza das moléculas que se estudan no blot) visualízase por incubación cun reactivo axeitado, orixinándose un depósito coloreado sobre o blot ou unha reacción quimioluminescente, que se rexistra nunha película fotográfica.

Nome[editar | editar a fonte]

Blot significa "mancha" ou "secar (tinta)" en inglés. As manchas de tinta secábanse tradicionalmente con papel secante (blotting paper), de modo que a mancha se transfería ao papel secante. Isto é análogo á transferencia de bandas ou manchas de moléculas separadas no xel que se transfiren á membrana de transferencia ou de blotting usada nestas técnicas de bioloxía molecular. Ás veces blotting ou blot tradúcense por "transferencia", pero o máis común é velos usados sen traducir. A primeira técnica moderna de blotting amplamente utilizada foi a inventada por Edwin Southern, polo que se chamou Southern blot. Despois descubríronse outros métodos parecidos de separación de moléculas que se denominaron facendo un xogo de palabras co apelido Southern (que tamén significaría "do sur"), e utilizáronse para elas nomes relacionados con puntos cardinais xeográficos como eastern blot, western blot, northern blot etc. Estes outros nomes non proceden dun apelido, polo que non hai necesariamente que escribilos con maiúscula, pero con frecuencia aparecen na literatrura tamén escritos con maiúscula por analoxía co Southern blot.

Southern blot[editar | editar a fonte]

O Southern blot é un método utilizado para a detección de secuencias específicas de ADN nunha mostra de ADN. O Southern blot combina a transferencia de fragmentos de ADN separados electroforeticamente a unha membrana filtro e a posterior detección dos fragmentos con sondas de hibridación.[1]

Southwestern blot[editar | editar a fonte]

O southwestern blot está baseado no Southern blot e utilízase para identificar e caracterizar proteínas que se unen ao ADN polas súas capacidades de unirse a sondas oligonucloeotídicas específicas.[2] As proteínas son separadas por electroforese en xel e despois son transferidas a membranas de nitrocelulosa similares ás usadas noutros tipos de blotting.

Northern blot[editar | editar a fonte]

O northern blot utilízase para a detección de ARN nunha mostra de ARNs e o estudo da expresión xénica. Os ARNs sepáranse por electroforese, transfírense a unha membrana por capilaridade e detéctanse por medio dunha sonda.

Northern blot inverso[editar | editar a fonte]

O northern blot inverso é unha variante do northern blot na que o ácido nucleico que queda inmobilizado na membrana é un conxunto de fragmentos illados de ADN (en vez de ARN), e a sonda utilizada é ARN extraído dun tecido e marcado radioactivamente. Moi útil para estudar o perfil de expresión xenética.

Western blot[editar | editar a fonte]

O western blot utilízase para separar proteínas nunha mostra de tecido homoxenada. Faise unha electroforese para separar as proteinas, transfírense á membrana e despois detéctanse con anticorpos.

Far-western blot[editar | editar a fonte]

O far-western blot deriva do western blot e utilízase para detectar interaccións proteína-proteína. A diferenza do western blot, para detectar a proteína de interese, non utiliza anticorpos, senón outra proteína que se une á proteína estudada.

Eastern blot[editar | editar a fonte]

O eastern blot deriva tamén do western blot. Faise unha electroforese primeiro e despois transfírense as moléculas á membrana. Utilízase para estudar modificacións postraducionais, e detecta modificacións nas proteínas como a unión de grupos lipídicos, de carbohidratos, fosforilacións etc. Detecta as moléculas pola interacción específica de sondas directamente coa modificación postraducional (non co resto da proteína).

Dot blot[editar | editar a fonte]

No dot blot non se realiza primeiro unha electroforese, senón que a mestura coas moléculas se coloca directamente sobre puntos da membrana. Seguidamente faise unha detección similar á doutros métodos por medio de sondas de nucleótidos (para northern blot e Southern blot) ou por medio de anticorpos (para western blot).[3]

Far-eastern blot[editar | editar a fonte]

O far-eastern blot[4] utilízase principalmente para a análise de lípidos (ou tamén de metabolitos de fármacos, hormonas e outros compostos) que foron separados por cromatografía de capa fina de alto rendemento (HPTLC) e despois transferidos a unha membrana, para ser analizados por medio de ensaios encimáticos ou de unión de ligandos[4] ou por espectrometría de masas.[5]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. Towbin et al.; Staehelin, T; Gordon, J (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". PNAS 76 (9): 4350. doi 10.1073/pnas.76.9.4350. PMID 388439.
  2. Bowen B, Steinberg J, Laemmli UK, Weintraub H (January 1980). "The detection of DNA-binding proteins by protein blotting". Nucleic Acids Res. 8 (1): 1–20. PMC 327239. PMID 6243775. doi:10.1093/nar/8.1.1. 
  3. Protocolo da dot blot, abcam
  4. 4,0 4,1 D. Ishikawa and T. Taki (1998). "Micro-scale analysis of lipids by far-eastern blot (TLC blot)". Nihon yukagaku kaishi 47 (10): 963–970. doi:10.5650/jos1996.47.963. 
  5. Hamasaki H, Aoyagi M, Kasama T, Handa S, Hirakawa K, Taki T (January 1999). "GT1b in human metastatic brain tumors: GT1b as a brain metastasis-associated ganglioside". Biochim. Biophys. Acta 1437 (1): 93–9. PMID 9931455. doi:10.1016/S1388-1981(98)00003-1.