Ensaio de retardo na mobilidade electroforética

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Saltar ata a navegación Saltar á busca
No carreiro ou pista 1 do xel hai un control negativo, que contén só material xenético. O carreiro 2 contén proteína e tamén un fragmento de ADN que, baseándose na súa secuencia, non interacciona. O carreiro 3 contén a proteína e o fragmento de ADN que non reacciona; o complexo resultante é meirande, máis pesado, e móvese máis lentamente. O patrón mostrado no carreiro 3 é un dos que resultaría se todo o ADN estivese unido e non houbese disociación do complexo durante a electroforese. Cando non se dan estas condicións pode verse unha segunda banda no carreiro 3 que indica a presenza de ADN libre ou a disociación do complexo ADN-proteína.

Un ensaio de retardo na mobilidade electroforética ou EMSA (do inglés electrophoretic mobility shift assay), tamén chamado electroforese de retardo de mobilidade, ensaio de retardo en xel, ensaio de retardo de mobilidade en xel, ensaio de retardo de banda, ou ensaio de retardo en xel, é unha técnica común de electroforese de afinidade utilizada para estudar interaccións proteína-ADN e proteína-ARN. Este procedemento pode determinar se unha proteína ou mestura de proteínas pode unirse a unha secuencia dada de ADN ou ARN, e pode ás veces indicar se está implicada máis dunha molécula de proteína no complexo de unión. Os ensaios de retardo en xel realízanse a miúdo in vitro xunto cun perfil de DNase, unha extensión de cebador, e experimentos de promotor-sonda cando se estuda a iniciación da transcrición, replicación do ADN, reparación do ADN ou procesamento e maduración do ARN. Aínda que na literatura poden encontrarse métodos precursores desta técnica, a maioría dos ensaios actuais deste tipo están baseados nos métodos descritos por Garner e Revzin [1] e Fried e Crothers.[2]

Principio[editar | editar a fonte]

Un ensaio de retardo de mobilidade é a separación electroforética dunha mestura de proteína–ADN ou proteína–ARN en xel de poliacrilamida ou agarosa durante un curto período (unhas 1,5-2 horas para un xel de 15 a 20 cm).[3] A velocidade á cal diferentes moléculas (e combinacións delas) se moven a través do xel está determinada polo seu tamaño e carga, e en menor medida, pola súa forma (ver electroforese en xel). O carreiro de control (no que hai unha sonda de ADN sen proteína) contén unha soa banda correspondente ao fragmento de ADN ou ARN non unido. Porén, asumindo que a proteína pode unirse ao fragmento, o carreiro con proteína conterá outra banda que representa o complexo de maior tamaño e menor mobilidade da sonda de ácido nucleico unida á proteína, a cal queda retardada no xel (xa que se moveu máis lentamente).

Baixo as condicións experimentais correctas, a interacción entre o ADN (ou ARN) e a proteína é estabilizada e a proporción de ácido nucleico unido respecto ao non unido no xel reflicte a fracción de moléculas de sonda libres e unidas a medida que a reacción de unión entra no xel. Esta estabilidade é en parte debida a un "efecto gaiola", polo cal a proteína, rodeada pola matriz do xel, é incapaz de difundir lonxe da sonda antes de que se recombinen.[4] Se se coñecen as concentracións iniciais de proteína e de sonda, e tamén a estequiometría do complexo, pode determinarse a afinidade aparente da proteína pola secuencia de ácido nucleico.[5] A non ser que o complexo teña unha vida moi longa nas condicións do xel, ou sexa tomada en conta a disociación durante a electroforese, o número é unha Kd aparente. Se non se coñece a concentración de proteína pero si a estequiometría do complexo, pode determinarse a concentración da proteína ao incrementar a concentración da sonda de ADN ata que maiores incrementos non aumenten a fracción de proteína unida. Pode calcularse o número de moles de proteína facendo unha comparación cun conxunto de dilucións estándar de sonda libre corrida no mesmo xel.[3]

Pode engadirse a esta mestura un anticorpo que recoñece a proteína para crear un complexo aínda maior cun maior retardo. Este método denomínase ensaio de superretardo (supershift assay), e utilízase para identificar sen ambigüidade unha proteína presente no complexo proteína–ácido nucleico.

A miúdo, córrese un carreiro extra cun oligonucleótido competidor para determinar a secuencia de unión máis favorable para a unión da proteína. O uso de diferentes oligonucleótidos de secuencias definidas permite a identificación do sitio de unión específico por competición (non mostrado na imaxe). Variantes do ensaio de competición son útiles para medir a especificidade de unión e para medir as cinéticas de asociación e disociación.

Unha vez que se determina a unión ADN-proteína in vitro, varios algoritmos in silico poden estreitar o campo de investigación para a identificación do factor de transcrición. Os oligonucleótidos da secuencia consenso para o factor de transcrición de interese poden competir pola unión, eliminando a banda retardada, e deben ser confirmados por superretardo (supershift). Se a secuencia consenso predita non pode competir pola unión, a identificación do factor de transcrición pode ser axudada polo Competidor Multiplexado EMSA (MC-EMSA), polo cal grandes conxuntos de secuencia consenso son multiplexados en cada reacción, e onde un conxunto compite por unirse, a secuencia consenso individual deste conxunto córrese noutra reacción.[6]

Para propósitos de visualización, o fragmento de ácido nucleico márcase xeralmente cun isótopo radioactivo, un marcador fluorescente ou biotina. A tinguidura estándar con bromuro de etidio é menos sensible que estes métodos e pode carecer de sensiblidade para detectar o ácido nucleico se nestes experimentos se utilizan pequenas cantidades de ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos monocatenarios. Cando se usa un etiquetado con biotina, utilízase para detectar o fragmento de ADN a estreptavidina conxugada a un encima como a peroxidase de ravo picante (Armoracia rusticana) (ver EMSA non radioactivo). Aínda que a etiquetaxe do ADN ten pouco ou ningún efecto sobre a afinidade de unión á proteína, o uso de etiquetas non isotópicas incluíndo os fluoróforos ou a biotina poden alterar a afinidade ou esteiquiometría da interacción coa proteína de interese. A competición entre a sonda unida a fluoróforo ou biotina e o ADN non etiquetado da mesma secuencia pode usarse para determinar se a etiqueta altera a afinidade de unión ou a estequiometría.

Notas[editar | editar a fonte]

  1. Garner MM, Revzin A (July 1981). "A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system". Nucleic Acids Res. 9 (13): 3047–60. PMC 327330. PMID 6269071. doi:10.1093/nar/9.13.3047. 
  2. Fried M, Crothers DM (December 1981). "Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis". Nucleic Acids Res. 9 (23): 6505–25. PMC 327619. PMID 6275366. doi:10.1093/nar/9.23.6505. 
  3. 3,0 3,1 Ausubel, Frederick M. (1994). Current Protocols in molecular biology. Chichester: John Wiley & Sons. pp. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1. 
  4. Fried MG, Liu G. (1994). "Molecular sequestration stabilizes CAP- DNA complexes during polyacrylamide gel electrophoresis". Nucleic Acids Research 22(23): 5054-5059. doi: 10.1093/nar/22.23.5054. PMID 7800499.
  5. Fried MG (1989) "Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay". Electrophoresis 10, 366-376. PMID 2670548.
  6. Smith AJ, Humphries SE (January 2009). "Characterization of DNA-binding proteins using multiplexed competitor EMSA". J. Mol. Biol. 385 (3): 714–7. PMID 19059416. doi:10.1016/j.jmb.2008.11.035. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas[editar | editar a fonte]

Protocolos