Micromatriz de proteínas

Unha micromatriz de proteínas (protein microarray), chip de proteínas ou microarranxo de proteínas é un método de alto rendemento usado para estudar as interaccións e actividades das proteínas e determinar as súas funcións, e as funcións a grande escala. A súa principal vantaxe débese a que se poden estudar en paralelo un gran número de proteínas. O chip consta dunha superficie de soporte como unha lámina de vidro, membrana de nitrocelulosa, bólas, ou placa de microtitulación, á cal se une unha matriz (array) de proteínas de captura. Engádense á matriz moléculas usadas como sondas, normalmente etiquetadas con tinguidura fluorescente. Calquera reacción entre a sonda e as proteínas inmobilizadas emite un sinal fluorescente que se le por medio dun escáner láser. As micromatrices de proteínas son de funcionamento rápido, automatizado, son económicas e moi sensibles, e só consomen pequenas cantidades de mostras e reactivos. O concepto e metodoloxía das micromatrices de proteínas foi introducido e ilustrado primeiramente en micromatrices de anticorpos ou antibody microarrays (tamén chamadas matrices de anticorpos) en 1983 nunha publicación científica e unha serie de patentes. A tecnoloxía de alto rendemento que está detrás das micromatrices de proteínas foi relativamente doada de desenvolver, xa que estaba baseada na tecnoloxía desenvolvida para as micromatrices de ADN, que se converteran nas micromatrices máis amplamente utilizadas.

Motivación para o desenvolvemento

As micromatrices de proteínas desenvolvéronse debido ás limitacións que tiña o uso de micromatrices de ADN para determinar os niveis de expresión xénica en proteómica. As cantidades de ARNm na célula adoitan non reflectir os niveis de expresión das proteínas ás que corresponden. Como xeralmente é a proteína e non o ARNm a que ten o papel funcional na resposta da célula, compría utilizar unha estratexia nova centrada nas proteínas. Ademais as modificacións postraducionais, que son a miúdo críticas para determinar a función da proteína, non son visibles nas micromatrices de ADN. As micromatrices de proteínas substitúen as técnicas proteómicas tradicionais como a electroforese en xel bidimensional ou a cromatografía, que requiren bastante tempo e moito traballo e non son as máis axeitadas para analizar proteínas pouco abundantes.

Construción da matriz

As proteínas sitúanse nunha superficie sólida como un portaobxectos de microscopía, membranas, bólas ou placas de microtitulación. A función desta superficie é proporcionar un soporte sobre o cal poidan inmobilizarse as proteínas. Este debería ter propiedades de unión máximas e á vez manter a conformación nativa da proteína para que se conserven as súas capacidades de unión a moléculas. Os portaobxectos feitos de vidro ou silicona son moi utilizados porque son compatibles con colocadores das proteínas robóticos habituais e os escáneres láser que foron desenvolvidos para a tecnoloxía das micromatrices de ADN. As láminas de película de nitrocelulosa son as máis aceptadas como o substrato coa máxima capacidade de unión para proteínas nas aplicacións das micromatrices de proteínas.

A superficie sólida elixida é despois cuberta cun recubrimento que debe desempeñar simultaneamente as funcións de inmobilizar a proteína, impedir a súa desnaturalización, orientala na dirección apropiada para que os sitios de unión sexan accesibles, e proporcionar un ambiente hidrófilo no cal poida ocorrer a reacción de unión. Ademais, tamén necesita presentar unha capacidade de unión non específica o menor posible para minimizar o ruído de fondo no sistema de detección. Ademais, debe ser compatible con diferentes sistemas de detección. Entre os axente inmobilizadores están capas de aluminio ou ouro, polímeros hidrófilos e xeles de poliacrilamida, ou tratamentos con aminas, aldehidos ou epoxis. Empréganse tecnoloxías de capa fina como a deposición de vapor física (PVD) e a deposición de vapor química (CVD) para aplicar a cuberta á superficie de soporte.

É esencial un ambiente acuoso en todas as fases de fabricación dunha micromatriz e operar de modo que se impida a desnaturalización das proteínas. Por tanto, hai que regular coidadosamente os tampóns de mostra para que conteñan unha alta porcentaxe de glicerol (para diminuír o punto de conxelación) e a humidade do ambiente de fabricación. Os micropozos teñen a dobre vantaxe de que proporcionan un ambiente acuoso á vez que impiden a contaminación cruzada entre mostras.

No tipo máis común de matriz proteica, os robots sitúan grandes cantidades de proteínas ou os seus ligandos sobre un soporte sólido cuberto cun padrón predefinido. Isto coñécese como impresión de contacto robótico ou punteado robótico (robotic spotting). Outro método de fabricación é a impresión por chorro de "tinta", un método que non toma contacto directo e deposita só cando se demanda para dispersar os polímeros proteicos sobre a superficie sólida co padrón desexado. O punteado piezoeléctrico (piezoelectric spotting) é un método similar para esta impresión por chorro. A cabeza de impresión móvese a través da matriz e en cada punto usa estmulación eléctrica para depositar as moléculas proteicas sobre a superficie por medio de diminutos chorros. Trátase tamén dun proceso sen contacto directo coa matriz. A fotolitografía é o cuarto método para dispoñer as proteínas sobre a superficie. Utilízase a luz en asociación con fotomáscaras, placas opacas con buratos ou transparencias que permiten que a luz brille a través cun padrón definido. Despois, unha serie de tratamentos químicos permiten o depósito da proteína co padrón desexado sobre o material que está baixo a fotomáscara.

As moléculas de captura dispostas sobre a superfice sólida poden ser anticorpos, antíxenos, aptámeros (ligandos baseados en ácidos nucleicos), aficorpos (ou Affibodies, pequenas moléculas preparadas por enxeñaría para imitar anticorpos monoclonais), ou proteínas completas. Entre as fontes de ditas proteínas están sistemas de expresión baseados en células para proteínas recombinantes, purificación a partir de fontes naturais, produción in vitro por sistemas de tradución libres de células e métodos de síntese para péptidos. Moitos destes métodos poden ser automatizados para unha produción de alto rendemento, mais debe terse coidado de evitar condicións de síntese ou extracción que teñan como resultado a desnaturalización das proteínas, que xa non poderían recoñecer a molécula coa que se teñen que unir, o que faría que a matriz fose inútil.

As proteínas son moi sensibles aos cambios no seu microambiente. Isto supón un reto para manter as matrices de proteínas en condicións estables durante períodos de tempo longos. Os métodos in situ, inventados e publicados por Mingyue He e Michael Taussig en 2001, implican a síntese sobre o chip de proteínas como e cando se necesitan, directamente a partir do ADN que a codifica usando sistemas de expresión de proteínas libres de células. Como o ADN é unha molécula moi estable non se deteriora co tempo e, por tanto, é moi apropiada para o almacenamento a longo prazo. Este enfoque é tamén vantaxoso porque evita os laboriosos e a miúdo custosos procesos de purificación de proteínas por separado e a clonación de ADN, xa que as proteínas son producidas e inmobilizadas simultaneamente nun só paso sobre a superficie do chip. Exemplos de técnicas in situ de matrices de proteínas libres de células son: PISA (protein in situ array, matriz in situ de proteínas), NAPPA (nucleic acid programmable protein array, matriz de proteínas programable de ácido nucleico) e DAPA (DNA array to protein array, matriz de ADN para matriz de proteínas).

Tipos de matrices

Tipos de matrices de proteínas

Hai tres tipos de micromatrices de proteínas que se usan actualmente para estudar as actividades bioquímicas das proteínas.

As micromatrices analíticas son tamén coñecidas como matrices de captura. Nesta técnica, sitúanse sobre a superficie de soporte unha biblioteca de anticorpos, aptámeros ou aficorpos (Affibodies). Estes son utilizados para capturar moléculas, xa que cada un se une especificamente a unha determinada proteína. A matriz é sondada cunha solución complexa de proteínas como un lisado celular. A análise das reaccións de unión resultantes producidas usando varios sistemas de detección pode proporcionar información sobre niveis de expresión de determinadas proteínas da mostra, así como medicións das afinidades de unión e especificidades. Este tipo de micromatriz é especialmente útil para comparar a expresión de proteínas en diferentes solucións. Por exemplo, pode identificarse a resposta das células a un determinado factor comparando os lisados das células tratadas con substancias específicas ou cultivadas baixo certas condicións cos lisados das células control. Outra aplicación é na identificación e perfil de tecidos enfermos.

As micromatrices de proteínas en fase inversa (RPPA; reverse phase protein microarray) requiren o uso de mostras complexas como os lisados de tecidos. As células íllanse de varios tecidos de interese e son lisadas. Os lisados dispóñense sobre a micromatriz e sóndanse con anticorpos contra a proteína diana de interese. Estes anticorpos son detectados tipicamente con ensaios quimioluminescentes, fluorescentes ou colorimétricos. Os péptidos de referencia imprímense sobre os portaobxectos para que se poida cuantificar a proteína dos lisados da mostra. As matrices de fase inversa (RPA) permiten a determinación da presenza de proteínas alteradas ou outros axentes que poden ser o resultado da enfermidade. Especificamente, poden detectarse usando matrices de fase inversa as modificacións postraducionais, que son tipicamente alteradas como resultado de enfermidades.

Micromatrices de proteínas funcionais

As micrfomatrices de proteínas fncionais (tamén chamadas matrices de proteínas diana) constrúense inmobilizando grandes cantidades de proteínas purificadas e utilízanse para identificar as interaccións proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN, proteína-fosfolípido e proteína-pequena molécula, para facer ensaios de actividade encimática e para detectar anticorpos e demostrar as súas especificidades. Difiren das matrices analíticas en que as matrices de proteínas funcionais están compostas de matrices que conteñen proteínas funcionais completas ou dominios proteicos. Estes chips de proteínas utilízanse para estudar as actividades bioquímicas do proteoma completo nun só experimento.

O elemento clave en calquera ensaio baseado en micromatriz de proteínas funcional é que as proteínas da matriz deben manter a súa estrutura nativa, esas significativas interaccións funcionais poden ter lugar na superficie da matriz. As vantaxes de controlar o modo preciso de unión á superficie polo uso dunha etiqueta de afinidade apropiada son que as proteínas inmobilizadas terán unha orientación homoxénea como resultado dunha actividade específica maior e unha proporción maior sinal-ruído nos ensaios, con menos interferencia de interaccións non específicas.

Detección

Os métodos de detección de matrices de proteínas deben dar un sinal alto e un baixo ruído de fondo. O método máis común e de amplo uso para a detección é o etiquetado fluorescente, que é moi sensible, seguro e compatible cos escáneres de láser de micromatrices dispoñibles. Poden usarse outras etiquetas, como etiquetas de afinidade, fotoquímicas ou radioisótopos. Estas etiquetas están unidas á propia sonda e poden interferir coa reacción sonda-proteína diana. Porén, disponse tamén de varios métodos de detección sen etiquetas, como a resonancia plasmónica de superficie (SPR), nanotubos de carbono, sensores de nanocables de carbono (nos que a detección ocorre por cambios na condutancia) e soportes de sistema microelectromecánico (MEMS). Todos estes métodos de detección sen etiquetas son relativamente novos e non están aínda dispoñibles para a detección de proteínas de alto rendemento; porén, son moi prometedores para o futuro.

A cuantificación de proteínas en láminas de cristal cubertas de nitrocelulosa pode usar detección fluorescente de infravermello próximo. Isto limita as interferencias debidas á autofluorescencia da nitrocelulosa nas lonxitudes de onda ultravioletas usadas nas sondas de detección fluorescentes estándar.

Aplicacións

Hai cinco grandes áreas nas que se están aplicando as matrices de proteínas: diagnósticos, proteómica, análise funcional de proteínas, caracterización de anticorpos e desenvolvemento de tratamentos médicos.

Facer un diagnóstico ás veces implica a detección de antíxenos e anticorpos en mostras sanguíneas; o perfil de soros para descubrir biomarcadores de novas enfermidades; a monitorización de estados de enfermidade e respostas a terapias en medicina personalizada; a monitorización de ambientes e alimentos. O bioensaio dixital é un exemplo de uso de micromatrices de proteínas para facer diagnósticos. Nesta tecnoloxía, unha matriz de micropozos nun chip de cristal/polímero son sementados con bólas magnéticas (cubertas con anticorpos etiquetados fluorescentemente), suxeitos a antíxenos diana e despois caracterizados con microscopio contando os pozos fluorescentes. Recentemente presentouse unha plataforma de fabricación rendible economicamente (que usa polímeros OSTE) para ditas matrices de micropozos e caracterizouse con éxito o sistema modelo de bioensaio.

A proteómica trata do perfil de expresión de proteínas, é dicir, que proteínas son expresadas no lisado dunha determinada célula.

A análise funcional de proteínas é a identificación das interaccións proteína-proteína (por exemplo, a identificación dos membros dun complexo de proteinas), as interaccións proteína-fosfolípido, dianas de pequenas moléculas, substratos encimáticos (particularmente os substratos de quinases) e ligandos de receptores.

A caracterización de anticorpos faise estudando a reactividade cruzada, e a especificidade e mapado de epítopos.

O desenvolvemento de tratamentos médicos implica o desenvolvemento de terapias específicas de antíxeno para a autoinmunidade, cancro e alerxias, e a identificación de dianas de pequenas moléculas que potencialmente poderían utilizarse como novos fármacos.

Retos

Malia os considerables investimentos realizados por varias compañías, os chips de proteínas aínda non inundaron o mercado. Os fabricantes atoparon que as proteínas son, en realidade, difíciles de manexar. A produción de proteínas fiable, consistente e de alto rendemento que estean correctamente pregadas e sexan funcionais está inzada de dificultades. Un chip de proteínas require moitos máis pasos para a súa creación que un chip de ADN.

Hai varias estratexias para afrontar este problema que difiren fundamentalmente en se as proteínas están inmobilizadas por medio de interaccións non específicas mal definidas ou por un conxunto específico de interaccións coñecidas. Esta última estratexia é atractiva pola súa simplicidade e é compatible con proteínas purificadas derivadas de fontes nativas e recombinantes pero presenta varios riscos. O máis notable destes está relacionado coa natureza incontrolada das interaccións entre cada proteína e a superficie; no mellor dos casos, isto podería dar lugar a unha poboación heteroxénea de proteínas na cal os sitios activos están ás veces ocluídos pola superficie, e no peor dos casos, podería destruír a actividade por completo debido ao despregamento parcial ou completo mediado pola superficie da proteína inmobilizada.

Os principais retos desta tecnoloxía son: 1) atopar unha superficie e un método de adhesión a ela que permita que as proteínas manteñan as súas estruturas secundaria e terciaria e así a súa actividade biolóxica e as súas interaccións con outras moléculas, 2) producir unha matriz cun longo tempo de caducidade ou vida útil para que as proteínas do chip non se desnaturalicen en curto tempo, 3) identificar e illar anticorpos ou outras moléculas de captura contra cada proteína do xenoma humano, 4) cuantificar os niveis de proteína unida á vez que se asegura a sensibilidade e se evita o ruído de fondo, 5) extraer a proteína detectada do chip para analizala posteriormente, 6) reducir as unións non específicas cos axentes de captura, 7) a capacidade do chip debe ser suficiente como para permitir a visualización dunha representación do proteoma tan completa como sexa posible; as proteínas abundantes ocultan a detección das menos abundantes como moléculas de sinalización e receptores, que son xeralmente de maior interese terapéutico.