ADN recombinante: Diferenzas entre revisións
| Liña 49: | Liña 49: | ||
== Propiedades dos organismos que conteñen ADN recombinante == |
== Propiedades dos organismos que conteñen ADN recombinante == |
||
| ⚫ | |||
| ⚫ | |||
| ⚫ | Na maioría dos casos, os organismos que conteñen ADN recombinante teñen aparentemente [[fenotipo]]s normais. É dicir, a súa aparencia, comportamento e [[metabolismo]] non son normalmente cambiados e o único modo de demostrar a presenza de secuencias recombianntes é examinar o propio ADN, normalmente usando un test de [[PCR]].<ref name="isbn1-4051-1121-6">{{cite book |author=Brown, Terry |title=Gene Cloning and DNA Analysis: an Introduction |publisher=Blackwell Pub |location=Cambridge, MA |year=2006 |pages= |isbn=978-1-4051-1121-8 |oclc= |doi= }}</ref> Hai tamén excepcións significativas, que se discuten máis abaixo. |
||
If the rDNA sequences encode a gene that is expressed, then the presence of RNA and/or protein products of the recombinant gene can be detected, typically using [[RT-PCR]] or [[Western blot|western hybridization]] methods.<ref name="isbn1-4051-1121-6"/> Gross phenotypic changes are not the norm, unless the recombinant gene has been chosen and modified so as to generate biological activity in the host organism.<ref name="pmid|10634784">{{Cite journal |
|||
Se as secuencias de ADN recombinante codifican un xene que se expresa, entón pode detectarse a presenza de ARN e/ou produtos proteicos do xene recombinante, xeralmente usando as técnicas da [[RT-PCR]] ou do [[western blot]].<ref name="isbn1-4051-1121-6"/> Os cambios fenotípicos grandes non son o normal, a non sder que o xene recombinante fose elixido e modificado para xerar unha actividade biolóxica no organismo hóspede.<ref name="pmid|10634784">{{Cite journal |
|||
| last1 = Ye | first1 = X. |
| last1 = Ye | first1 = X. |
||
| last2 = Al-Babili | first2 = S. |
| last2 = Al-Babili | first2 = S. |
||
| Liña 68: | Liña 68: | ||
| pmid = 10634784 | doi=10.1126/science.287.5451.303 |
| pmid = 10634784 | doi=10.1126/science.287.5451.303 |
||
| bibcode = 2000Sci...287..303Y |
| bibcode = 2000Sci...287..303Y |
||
}}</ref> Os fenotipos adicionais que se poden encontrar son toxicidade no organismo hóspede inducida polo produto recombinante, especialmente se este é sobreexpresado ou expresado en células ou tecidos inapropiados. |
|||
}}</ref> Additional phenotypes that are encountered include toxicity to the host organism induced by the recombinant gene product, especially if it is [[Protein expression (biotechnology)|over-expressed]] or expressed within inappropriate cells or tissues. |
|||
Nalgúns casos, o ADN recombinante pode ter efectos deletéreos incluso se non é expresado. Un mecanismo polo cal pode ocorrer isto é a [[Inserción (xenética)|inactivación inseccional]], na cal o ADN recombinante queda inserido nun xene da célula hóspede. Nalgúns casos, pode utilizarse este fenómeno para facer un [[knockout de xenes]] para determinar a súa función biolóxica e importancia.<ref name="pmid1591000">{{Cite journal |
|||
| last1 = Koller | first1 = B. H. |
| last1 = Koller | first1 = B. H. |
||
| last2 = Smithies | first2 = O. |
| last2 = Smithies | first2 = O. |
||
| Liña 81: | Liña 81: | ||
| pmid = 1591000 |
| pmid = 1591000 |
||
| pmc = |
| pmc = |
||
}}</ref> Outro mecanismo polo cal a inserción do ADN recombinante no ADn cromosómico pode afectar á expresión xénica é pola inactivación inapropiada de xenes da célula hóspede que previamente non se expresaban. Isto pode acontecer, por exemplo, cando un fragmento de ADN recombinante que contén un promotor activo queda localizado pretotdun xene da célula hóspede previamente silencioso ou cando un xene da célula hóspede que funciona restrinxindo a expresión xénica sofre unha inactivación insercional polo ADN recombinante. |
|||
}}</ref> Another mechanism by which rDNA insertion into chromosomal DNA can affect gene expression is by inappropriate activation of previously unexpressed host cell genes. This can happen, for example, when a recombinant DNA fragment containing an active promoter becomes located next to a previously silent host cell gene, or when a host cell gene that functions to restrain gene expression undergoes insertional inactivation by recombinant DNA. |
|||
== Usos == |
== Usos == |
||
| ⚫ | |||
Recombinant DNA is widely used in [[biotechnology]], [[medicine]] and [[research]]. Today, recombinant proteins and other products that result from the use of DNA technology are found in essentially every western pharmacy, physician or veterinarian office, medical testing laboratory, and biological research laboratory. In addition, organisms that have been manipulated using recombinant DNA technology, as well as products derived from those organisms, have found their way into many farms, [[Genetically modified food|supermarkets]], [[Humulin|home medicine cabinets]], and even pet shops, such as those that sell [[GloFish]] and other [[genetically modified animal]]s. |
Recombinant DNA is widely used in [[biotechnology]], [[medicine]] and [[research]]. Today, recombinant proteins and other products that result from the use of DNA technology are found in essentially every western pharmacy, physician or veterinarian office, medical testing laboratory, and biological research laboratory. In addition, organisms that have been manipulated using recombinant DNA technology, as well as products derived from those organisms, have found their way into many farms, [[Genetically modified food|supermarkets]], [[Humulin|home medicine cabinets]], and even pet shops, such as those that sell [[GloFish]] and other [[genetically modified animal]]s. |
||
Revisión como estaba o 6 de setembro de 2020 ás 18:39
 | Este artigo está a ser traducido ao galego por un usuario desta Wikipedia; por favor, non o edite. O usuario Miguelferig (conversa · contribucións) realizou a última edición na páxina hai 3 anos. Se o usuario non publica a tradución nun prazo de trinta días, procederase ó seu borrado rápido. |
O ADN recombinante (ADNr ou rDNA, pero isto tamén se usa para o ADN dos xenes do ARN ribosómico) é unha molécula de ADN formada por medio de métodos de laboratorio de recombinación xenética (como a clonación molecular) na que se xuntan materiais xenéticos de dúas ou máis fontes, creando secuencias de ADN que doutro modo non formarían parte do xenoma.
O ADN recombinante é posible porque as moléculas de ADN de todos os organismos comparten a mesma estrutura química e só difiren na secuencia de nucleótidos dentro dunha mesma estrutura global. As moléculas de ADN recombinante denomínanse ás veces ADN quimérico, porque poden facerse con material de dúas especies, como as míticas quimera. A tecnoloxía do ADN recombinante usa secuencias palindrómicas e produce extremos coherentes ou romos no ADN.
As secuencias de ADN usadas na construción de moléculas de ADN recombinante poden proceder de calquera especie. Por exemplo, ADN dunha planta pode unirse con ADN bacteriano, ou ADN humano con ADN de fungo. Ademais, poden crearse secuencias de ADN que non aparecen en ningunha parte na natureza por síntese química de ADN e despois poden incorporarse ás moléculas recombinantes. Couso da tecnoloxía do ADN recombinante e do ADN sintético, literalmente pode crfearse calquera secuencia de ADN e introducida nunha ampla variedade de organismos vivos.
As proteínas que poden orixinarse da expresión dun ADN recombinante nas células vivas denomínanse proteínas recombinantes. Cando o ADN recombinante que codifica proteínas se introduce nun organismo hóspede, non necesariamente se vai producir a proteína recombinante.[1] A expresión de proteínas alleas require o uso de vectores de expresión especializados e adoita necesitar unha significativa reestruturación por secuencias codificantes alleas.[2]
O ADN recombinante é distinto da recombinación xenética porque a primeira se orixina por medios artificiais no tubo de ensaio, mentres que a última é un proceso biolóxico normal no que se remesturan secuencias de ADN xa existentes dentro dun organismo.
Creación
- Artigo principal: Clonación molecular.
A clonación molecular é o método de laboratorio usado para crear ADN recombinante.[3][4][5][6] É un dos dosu métodos máis amplamente usados, xunto coa reacción en cadea da polimerase (PCR), usada para dirixir a replicación de calquera secuencia específica de ADN desexada. Hai dúas diferenzas fundamentais entre os dous métidos. Unha é que a clonación molecular implica a replicación do ADN dentro dunha célula viva, mentres que a PCR replica o ADN nun tubo de ensaio, sen células vivas. Outra diferenza é que a clonación implica cortar e pegar secuencias de ADN, mentres que a PCR amplifica copiándoa unha secuencia existente.
A formación do ADN recombinante require un vector de clonación, unha molécula de ADN que leve o ADN ao interior da célula viva. Os vectores xeralmente derivan de plásmidos ou virus e son segmentos relativamente pequenos de ADN que conteñen os sinais xenéticos necesarios para a replicación, así como elementos adicionais convenientes no ADN alleo inserido, que identifican as células que conteñen o ADN recombinante e, cando é apropiado, expresan o ADN alleo. A elección do vector para unha clonación molecular depende do organismo hóspede utilizado, o tamaño do ADN que vai ser clonado e de se o ADn alleo vai ser expresado e como.[7] Os segmentos de ADN poden combinarse usando unha variedade de métodos, como a clonación con encimas de restrición/ligases ou a ensamblaxe de Gibson.
Nos protocolos de clonación estándar, a clonación dun fragmento de ADN implica esencialmente sete pasos: (1) Elección do organismo hóspede e do vector de clonación, (2) Preparación do ADN vector, (3) Preparación do ADN que vai ser clonado, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introdución do ADN recombinante no organismo hóspede, (6) Selección dos organismos que conteñen o ADN recombinante e (7) Cribado buscando os clons co ADN desexado inserido e as súas propiedades biolóxicas.[6] (Para máis detalle ver clonación molecular).
Expresión
- Artigo principal: Produción de proteínas.
Despois de transplantalo ao organismo hóspede, o ADn alleo contido no contruto do ADN recombinante pode ser expresado ou non. É dicir, o ADN pode simplemente replicarse sen expresarse ou pode ser transcrito e traducido e acaba orixinando unha proteína recombinante. Xeralmente, a expresión dun xene alleo require a reestruturación do xene para que inclúa secuencias que son necesarias para a produción da molécula de ARNm que servirá para a tradución (por exemplo, un promotor, un sinal de iniciación da tradución e un terminador da transcrición).[8] Poden facerse cambio espacíficos no organismo hóspede para mellorar a expresión do xene ectópico. Ademais, os cambios pode ser necesarios nas secuencias codificantes tamén, para optimizar a tradución, facer que a proteína sexa soluble, dirixir a proteína recombinante á unha localización celular ou extracelular axeitada e estabilizar a proteína ante a súa posible degradación.[9][10]
Propiedades dos organismos que conteñen ADN recombinante
Na maioría dos casos, os organismos que conteñen ADN recombinante teñen aparentemente fenotipos normais. É dicir, a súa aparencia, comportamento e metabolismo non son normalmente cambiados e o único modo de demostrar a presenza de secuencias recombianntes é examinar o propio ADN, normalmente usando un test de PCR.[11] Hai tamén excepcións significativas, que se discuten máis abaixo.
Se as secuencias de ADN recombinante codifican un xene que se expresa, entón pode detectarse a presenza de ARN e/ou produtos proteicos do xene recombinante, xeralmente usando as técnicas da RT-PCR ou do western blot.[11] Os cambios fenotípicos grandes non son o normal, a non sder que o xene recombinante fose elixido e modificado para xerar unha actividade biolóxica no organismo hóspede.[12] Os fenotipos adicionais que se poden encontrar son toxicidade no organismo hóspede inducida polo produto recombinante, especialmente se este é sobreexpresado ou expresado en células ou tecidos inapropiados.
Nalgúns casos, o ADN recombinante pode ter efectos deletéreos incluso se non é expresado. Un mecanismo polo cal pode ocorrer isto é a inactivación inseccional, na cal o ADN recombinante queda inserido nun xene da célula hóspede. Nalgúns casos, pode utilizarse este fenómeno para facer un knockout de xenes para determinar a súa función biolóxica e importancia.[13] Outro mecanismo polo cal a inserción do ADN recombinante no ADn cromosómico pode afectar á expresión xénica é pola inactivación inapropiada de xenes da célula hóspede que previamente non se expresaban. Isto pode acontecer, por exemplo, cando un fragmento de ADN recombinante que contén un promotor activo queda localizado pretotdun xene da célula hóspede previamente silencioso ou cando un xene da célula hóspede que funciona restrinxindo a expresión xénica sofre unha inactivación insercional polo ADN recombinante.
Usos
Notas
- ↑ Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo A. (2014-04-17). "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges". Frontiers in Microbiology 5: 172. ISSN 1664-302X. PMC 4029002. PMID 24860555. doi:10.3389/fmicb.2014.00172.
- ↑ "Promoters used to regulate gene expression". www.cambia.org. Consultado o 16 February 2018.
- ↑ Campbell, Neil A. & Reece, Jane B.. (2002). Biology (6th ed.). San Francisco: Addison Wesley. pp. 375–401. ISBN 978-0-201-75054-6.
- ↑ Peter Walter; Alberts, Bruce; Johnson, Alexander S.; Lewis, Julian; Raff, Martin C.; Roberts, Keith (2008). Molecular Biology of the Cell (5ª edición, ampliada). New York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4111-6.. A 4ª edición está dispoñible en liña no NCBI Bookshelf: link
- ↑ Berg, Jeremy Mark; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert (2010). Biochemistry, 7th ed. (Biochemistry (Berg)). W.H. Freeman & Company. ISBN 978-1-4292-2936-4. A 5ª edición estañ dispoñible en liña no NCBI Bookshelf: link
- ↑ 6,0 6,1 Watson, James D. (2007). Recombinant DNA: Genes and Genomes: A Short Course. San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 978-0-7167-2866-5.
- ↑ Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 978-0-87969-576-7. Parámetro descoñecido
|url-access=ignorado (Axuda) - ↑ Hannig, G.; Makrides, S. (1998). "Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli". Trends in Biotechnology 16 (2): 54–60. PMID 9487731. doi:10.1016/S0167-7799(97)01155-4.
- ↑ Brondyk, W. H. (2009). "Chapter 11 Selecting an Appropriate Method for Expressing a Recombinant Protein". Guide to Protein Purification, 2nd Edition. Methods in Enzymology 463. pp. 131–147. ISBN 9780123745361. PMID 19892171. doi:10.1016/S0076-6879(09)63011-1.
- ↑ Ortega, Claudia; Prieto, Daniel; Abreu, Cecilia; Oppezzo, Pablo Javier; Correa, Agustin (2018). "Multi-compartment and multi-host vector suite for recombinant protein expression and purification.". Frontiers in Microbiology (en English) 9: 1384. ISSN 1664-302X. PMC 6030378. PMID 29997597. doi:10.3389/fmicb.2018.01384.
- ↑ 11,0 11,1 Brown, Terry (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: an Introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 978-1-4051-1121-8.
- ↑ Ye, X.; Al-Babili, S.; Klöti, A.; Zhang, J.; Lucca, P.; Beyer, P.; Potrykus, I. (2000). "Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm". Science 287 (5451): 303–305. Bibcode:2000Sci...287..303Y. PMID 10634784. doi:10.1126/science.287.5451.303.
- ↑ Koller, B. H.; Smithies, O. (1992). "Altering Genes in Animals by Gene Targeting". Annual Review of Immunology 10: 705–730. PMID 1591000. doi:10.1146/annurev.iy.10.040192.003421.
Véxase tamén
Outros artigos
- Enxeñaría xenética
- Organismo modificado xeneticamente
- Virus recombinante
- Vector de ADN
- Clonación molecular
Bibliografía
- The Eighth Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology. Touchstone Books, ISBN 0-671-22540-5. 2nd edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 paperback: ISBN 0-87969-478-5.
- Micklas, David. 2003. DNA Science: A First Course. Cold Spring Harbor Press: ISBN 978-0-87969-636-8.
- Rasmussen, Nicolas, Gene Jockeys: Life Science and the rise of Biotech Enterprise, Johns Hopkins University Press, (Baltimore), 2014. ISBN 978-1-42141-340-2.
- Rosenfeld, Israel. 2010. DNA: A Graphic Guide to the Molecule that Shook the World. Columbia University Press: ISBN 978-0-231-14271-7.
- Schultz, Mark and Zander Cannon. 2009. The Stuff of Life: A Graphic Guide to Genetics and DNA. Hill and Wang: ISBN 0-8090-8947-5.
- Watson, James. 2004. DNA: The Secret of Life. Random House: ISBN 978-0-09-945184-6.
Ligazóns externas
- Recombinant DNA fact sheet (from University of New Hampshire)
- Plasmids in Yeasts (Fact sheet from San Diego State University)
- Animation illustrating construction of recombinant DNA and foreign protein production by recombinant bacteria
- Recombinant DNA research at UCSF and commercial application at Genentech Edited transcript of 1994 interview with Herbert W. Boyer, Living history project. Oral history.
- Recombinant Protein Purification Principles and Methods Handbook
