Mutaxénese de saturación

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Mutaxénese de saturación dunha soa posición nunha proteína teórica de 10 residuos. A versión de tipo salvaxe da proteína móstrase arriba, onde M representa o primeiro aminoácido, metionina, e * representa a terminación da tradución. Debaixo móstranse todos os 19 mutantes na posición 5.

A mutaxénese de saturación ou mutaxénese de saturación de sitios (SSM) ou, simplemente, sturación de sitios, é unha técnica de mutaxénese aleatoria usada na enxeñaría de proteínas, na cal un só codón ou conxunto de codóns é substituído por todos os posibles aminoácidos nesa posición.[1] Hai moitas variantes da técnica de saturación de sitio, desde a saturación de sitios emparellados (saturando dúas posicións en cada mutante da biblioteca) ata a saturación de sitios escaneados (realizando unha saturación de sitios en cada sitio da proteína, o que ten como resultado unha biblioteca de tamaño [20 x (número de residuos da proteína)] que contén cada posible mutante puntual da proteína).

Método[editar | editar a fonte]

Representación dun modo común de clonar unha biblioteca de mutaxénese dirixida a sitio (é dicir, usando oligos dexenerados). O xene de interese é sometido a PCR con oligos que conteñen unha rexión que é perfectamente complementaria ao molde (en azul), e unha que difire do molde nun ou máis nucleótidos (en vermello). Moitos deses cebadores que conteñen dexeneracións na rexión non complementaria son xuntados na mesma PCR, o que ten como resultado moitos produtos de PCR distintos con diferentes mutacións nesa rexión (os mutantes individuais móstranse con diferentes cores debaixo).

A mutaxénese de saturación conséguese normalmente por PCR de mutaxénese dirixida a sitio cun codón aleatoriado nos cebadores (por exemplo na mutaxénese de saturación de secuencias ou SeSaM)[2] ou por síntese de xenes artificiais, cunha mestura de nucleótidos de síntese usada nos codóns que van ser aleatorizados.[3]

Poden utilizarse diferentes codóns dexenerados para codificar conxuntos de aminoácidos.[1] Como algúns aminoácidos están codificados por máis codóns que outros, a proporción exacta de aminoácidos non pode ser igual. Ademais, é habitual usar codóns dexenerados que minimizan os codóns de stop (que xeralmente non se desexan). En consecuencia, o 'NNN' (ver abreviaturas na táboa) non completamente aleatorizado non é ideal, e como alternativa utilízanse codóns dexenerados máis restrinxidos. Os 'NNK' e 'NNS' teñen a vantaxe de codificar todos os 20 aminoácidos proteinoxénicos, pero seguen codificando codóns de stop nun 3% das veces. Codóns alternativos como 'NDT', 'DBK' evitan completamente os codóns de stop e codifican un mínimo conxunto de aminoácidos que comprenden todos os principais tipos biofísicos (aniónicos, catiónicos, alifáticos, hidrófobos, aromáticos hidrófobos, hidrófilos, pequenos).[1] No caso de que non haxa restricións para usar soamente un codón dexenerado, é posible reducir o nesgo considerablemente.[4][5] Desenvolvéronse varias ferramentas computacionais para permitir un alto nivel de control sobre os codóns dexenerados e os seus correspondentes aminoácidos.[6][7][8]

Codón dexenerado Número de codóns Número de aminoácidos Número de stops Aminoácidos codificados
NNN 64 20 3 Todos os 20
NNK / NNS 32 20 1 Todos os 20
NDT 12 12 0 RNDCGHILFSYV
DBK 18 12 0 ARCGILMFSTWV
NRT 8 8 0 RNDCGHSY

(Significado dos símbolos de bases nos codóns dexenerados: N = calquera base ; K = cetona ; S = forte ; D = non citosina ; T = timina ; B = non adenina ; R = purina. Os símbolos dos aminoácidos da última columna son os símbolos dunha letra dos aminoácidos proteinoxénicos).

Aplicacións[editar | editar a fonte]

A mutaxénese de saturación é utilizada xeralmente para xerar variantes para a evolución dirixida.[9][10]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. ↑ 1,0 1,1 1,2 Reetz, M. T.; Carballeira J. D. (2007). "Iterative saturation mutagenesis (ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes". Nature Protocols 2 (4): 891–903. PMID 17446890. doi:10.1038/nprot.2007.72. 
  2. ↑ Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (2004-07-15). "An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol". Nucleic Acids Research (en inglés) 32 (14): e115. ISSN 0305-1048. PMC 514394. PMID 15304544. doi:10.1093/nar/gnh110. 
  3. ↑ Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (2010-07-07). "Iterative Saturation Mutagenesis Accelerates Laboratory Evolution of Enzyme Stereoselectivity: Rigorous Comparison with Traditional Methods". Journal of the American Chemical Society 132 (26): 9144–9152. ISSN 0002-7863. PMID 20536132. doi:10.1021/ja1030479. 
  4. ↑ Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G.; Parra, Loreto P.; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J.; Reetz, Manfred T.; Acevedo, Juan Pablo (2013-02-15). "Reducing Codon Redundancy and Screening Effort of Combinatorial Protein Libraries Created by Saturation Mutagenesis". ACS Synthetic Biology 2 (2): 83–92. PMID 23656371. doi:10.1021/sb300037w. 
  5. ↑ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (xuño de 2014). "MDC-Analyzer: a novel degenerate primer design tool for the construction of intelligent mutagenesis libraries with contiguous sites". BioTechniques 56 (6): 301–302, 304, 306–308, passim. ISSN 1940-9818. PMID 24924390. doi:10.2144/000114177. 
  6. ↑ Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (16 de setembro de 2016). "A Web Interface for Codon Compression". ACS Synthetic Biology 5 (9): 1021–1023. ISSN 2161-5063. PMID 27169595. doi:10.1021/acssynbio.6b00026. 
  7. ↑ Engqvist, Martin K. M.; Nielsen, Jens (2015-04-30). "ANT: Software for Generating and Evaluating Degenerate Codons for Natural and Expanded Genetic Codes". ACS Synthetic Biology 4 (8): 935–938. PMID 25901796. doi:10.1021/acssynbio.5b00018. 
  8. ↑ Kell, Douglas B.; Day, Philip J.; Breitling, Rainer; Green, Lucy; Currin, Andrew; Swainston, Neil (2017-07-10). "CodonGenie: optimised ambiguous codon design tools". PeerJ Computer Science 3: e120. ISSN 2376-5992. doi:10.7717/peerj-cs.120. 
  9. ↑ Chica, Robert A.; et al. (2005). "Semi-rational approaches to engineering enzyme activity: combining the benefits of directed evolution and rational design". Current Opinion in Biotechnology 16 (4): 378–384. PMID 15994074. doi:10.1016/j.copbio.2005.06.004. 
  10. ↑ Shivange, Amol V; Marienhagen, Jan; Mundhada, Hemanshu; Schenk, Alexander; Schwaneberg, Ulrich (2009-02-01). "Advances in generating functional diversity for directed protein evolution". Current Opinion in Chemical Biology. Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry 13 (1): 19–25. PMID 19261539. doi:10.1016/j.cbpa.2009.01.019. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]

Traído desde «https://gl.wikipedia.org/w/index.php?title=Mutaxénese_de_saturación&oldid=6705556»