Test de Ames

O test de Ames é un ensaio in vitro de avaliación da capacidade mutaxénica das substancias químicas.

Características

A preocupación pola presenza de substancias químicas tóxicas e o descubrimento de mutáxenos no ambiente aumenta día a día a causa do risco de cancro e enfermidades hereditarias na poboación. Á hora de abordar experimentalmente o problema da mutaxénese non hai dúbida que o enfoque último está dirixido á propia especie humana. Agora ben, a experimentación con material humano in vivo non é factible e a utilización dos mamíferos como especies experimentais máis afíns ao ser humano resulta moitas veces un proceso longo e custoso, sobre todo tendo en conta que se trata de ensaiar gran número de posibles mutáxenos.

Considerando que o proceso mutacional no material hereditario humano responde a unha mesma base molécular con respecto a microorganismos como as bacterias ou os fungos resulta lóxico tratar de desenvolver técnicas experimentais que permitan detectar os efectos mutaxénicos sobre tales organismos máis simples; así se describiron as técnicas en bacterias e fungos.

O test de Ames, que debe o seu nome o seu inventor, Bruce Ames foi o primeiro ensaio de curta duración desenvolvido para detectar a mutaxenicidade dos axentes químicos. Grazas a este ensaio, demostrouse que o 60-90%-90 das substancias químicas canceríxenas eran á súa vez mutáxenas,

Principio

O test usa distintas cepas da bacteria Salmonella typhimurium. Esta é unha bacteria que pode medrar nun medio de cultivo sen histidina porque é capaz de sintetizala. Pero o test usa unha cepa mutante, modificada xeneticamente para que non poida sintetizar histidina, e, polo tanto, estas bacterias non medrarán nun medio sen este aminoácido.

As bacterias mutantes son expostas á substancia a ser avaliada. Se a substancia utilizada no test non é mutáxena, as bacterias non poden medrar, e polo tanto, non se formarán colonias no medio de cultivo empregado. Porén, se a substancia é mutáxena as bacterias recuperan a súa capacidade de sintetizar o aminoácido histidina, debido a que a súa mutación inicial é revertida, o que fai que a Salmonella Typhimurium xa non requira histidina para medrar, e se formen colonias.

A principal utilidade é a detección de substancias mutáxenas potencialmente canceríxenas, aínda que non tódalas substancias canceríxenas dan positivo neste test, e viceversa, non tódalas substancias positivas o test serán canceríxenas. Esta é unha proba de detección deseñada para detectar un axente mutáxeno/canceríxeno de xeito rápido e barato.

Procedemento

O proceso consiste na colocación de cepas mutantes nunha placa de Petri cun medio de cultivo sen histidina. Na placa, colócase un disco impregnado coa substancia que se vai avaliar. A placa métese nun forno a 37 °C (temperatura óptima para o crecemento de bacterias). En 24-48 horas, retírase a placa do forno e cóntase as colonias cultivadas na placa en comparación cunha placa control que non tiña substancia. Se estas placas dan un resultado semellante ao obtido no control, o axente químico non é mutáxeno. Se se observa o crecemento das colonias no medio pobre en histidina, o produto químico é mutáxeno,,

Activación metabólica

Algúns compostos químicos son activos directamente xa que son compostos que reaccionan cos centros nucleofílicos presentes no ADN, como por exemplo os epóxidos, N-óxidos aromáticos, considéranse compostos xenotóxicos directos. Non obstante, outros compostos necesitan dunha activación metabólica antes de ser activos. Convértense en activos pola acción dalgúns sistemas enzimáticos presentes na célula animal,,. É o caso de moitos carcinóxenos químicos, tales coma as aminas aromáticas ou os hidrocarburos aromáticos policíclicos, que son fisioloxicamente inactivos, pero transfórmanse en compostos activos despois de que o organismo os metabolice.

Nos seres humanos e animais, o cito cromo P-450 é responsable da maioría destes casos de activación metabólica. Pero como as bacterias non teñen esa capacidade metabólica, non poden por si mesmas facer esa activación, e polo tanto axentes potencialmente canceríxenos para o home poderían dar negativo neste test. Para corrixir este déficit débese engadir un sistema de activación metabólico esóxeno, que se extrae de órganos de animais ricos en enzimas. Concretamente emprégase a chamada fracción microsomal S-9, que se obtén de fígado de rata e que se engade na placa de Petri, xunto coa substancia de ensaio e as bacterias.

O produto debe probarse tanto en presenza como en ausencia de activación metabólica, para tratar de descubrir se se trata dun mutáxeno directo ou non.

Tipos de cepas de Salmonella typhimurium

No test empréganse distintas cepas da bacteria, que presentan diferentes mutacións deseñadas para responder anter mutáxenos que actúan por distintos mecanismos.

Todas as cepas son derivadas de S. typhimurium e requiren histidina. Adicionalmente á mutación para histidina, cada cepa presenta outras mutacións, que fan incrementar a súa sensibilidade para determinados mutáxenos. As cepas utilizadas para as probas xerais de mutaxenicidade son as seguintes: TA97, TA98, TA100, TA102, TA1535 e TA1538, aínda que algunhas cepas deixáronse de usar por diversos motivos (por exemplo, detección de poucos mutáxenos, substitución por outras máis sensibles, etc.).

Limitacións

O emprego dunha activación metabólica esóxena en células procariotas non emula con exactitude ás condicións in vivo de mamíferos, polo que esta proba non proporciona información directa da potencia mutáxena e/ou canceríxena dunha substancia en humanos.

1. Aínda que moitas substancias que son positivas para esta proba son canceríxenas en mamíferos, a correlación non é absoluta. Existen substancias canceríxenas non detectadas por esta proba debido a que os seus mecanismos de acción no son xeno tóxicos ou non se encontran presentes na bacteria.