Reacción en cadea da ligase

A reacción en cadea da ligase (ou LCR polas súas siglas en inglés de ligase chain reaction) é un método para a amplificación do ADN. A reacción en cadea da ligase é un proceso de amplificación que se diferencia da reacción en cadea da polimerase (PCR) en que utiliza unha ligase termostable para unir dúas sondas ou outras moléculas, que poden ser despois amplificadas por ciclos de PCR convencional. Cada ciclo ten como resultado dobrar a cantidade de moléculas do ácido nucleico diana. Unha vantaxe clave da LCR é a súa maior especificidade en comparación coa PCR. Así, a LCR require dous encimas completamente diferentes para funcionar axeitadamente: unha ligase, para unir as moléculas da sonda, e unha polimerase termoestable (por exemplo, a polimerase Taq) para amplificar aquelas moléculas implicadas na ligación exitosa. As sondas implicadas na ligación son deseñados de modo que o extremo 5' dunha sonda está en posición directamente adxacente ao extremo 3' da outra sonda, e dese modo proporciona os grupos substrato 3′-OH e 5′-PO4 necesarios para a ligase.

A LCR desenvolveuse orixinalmente para detectar mutacións puntuais; unha discordancia nunha soa base na unión das dúas moléculas sonda é todo o que cómpre para evitar a ligación. Realizando a ligación xusto á Tm (temperatura de fusión) da sonda oligonucleotídica, só se tolerarán os dúplex cebador:molde que concorden perfectamente. A LCR pode tamén utilizarse para amplificar moléculas molde que foron ligadas con éxito co propósito de avaliar a eficiencia da ligación e producindo unha gran cantidade de produto con incluso maior especificidade que a PCR. Así, a LCR non é necesariamente unha alternativa, senón máis ben un complemento, da PCR.

Condicións das dianas

Foi ampamente utilizada para a detección de mutacións dunha soa base, como as de moitas enfermidades xenéticas.

A LCR e a PCR poden utilizarse para detectar a gonorrea e a clamidia, e poden realizarse en mostras de urina first-catch urine, proporcionando unha doada recolida e un gran rendemento de organismos. Os inhibidores endóxenos limitan a sensibilidade, pero se este efecto puidese eliminarse, a LCR e a PCR terían vantaxes clínicas sobre calquera outro método de diagnóstico da gonorrea e clamidia. Entre todos estes métodos, a LCR está converténdose no método máis sensible con alta especificidade para a detección de SNP coñecidos. A LCR foi desenvolvida orixinalmente por Barany, que utilizou unha ADN ligase termoestable para discriminar entre o ADN normal e o mutante e para amplificar o produto específico de alelo. Unha discordancia no extremo 3' do cebador discriminador impide que a ADN ligase una os dous fragmentos. Utilizando ambas as febras do ADN xenómico como dianas para a hibridación de oligonucleótidos, os produtos xerados a partir de dous conxuntos de cebadores oligonucleótidos adxacentes, complementarios de cada febra diana nunha rolda de ligación, poden converterse en dianas para a seguinte rolda. A cantidade de produtos pode así ser incrementada exponencialmente por ciclos térmicos repetidos.

Véxase tamén

Outros artigos

• Amplificación de xenes

Bibliografía

• Walker, J. M., & Rapley, R. (2005). Medical biomethods handbook. Totowa, N.J.: Humana Press. ISBN 978-1-59259-870-0