Morfolino

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Segmento dun heterodúplex morfolino-ARN, do que se mostran 8-mer (8 pares de bases).

En bioloxía molecular un Morfolino ou "Morpholino" é unha molécula cunhas determinadas características estruturais, que se usa para modificar a expresión xenética. Os oligómeros Morfolino (oligos) son unha tecnoloxía antisentido usada para bloquear o acceso doutras moléculas a secuencias específicas dun ácido nucleico. Os morfolinos bloquean pequenas rexións (~25 bases) na superficie onde ten lugar o emparellamento de bases dun ARN.

Este artigo céntrase só nos oligos antisentido Morfolino, que son ánálogos de ácidos nucleicos. A palabra "morfolino" pode aparecer noutros termos químicos, referíndose a substancias químicas que conteñen un anel (molécula cíclica) morfolino de seis membros. Para evitar a confusión con outras moléculas que conteñen morfolinos, cando se describen os oligos "Morfolino" estes escríbense a miúdo con maiúscula como un nome comercial, aínda que este uso non sempre é coherente na literatura cienctífica. Os Morfolinos denomínanse ás veces "PMO" (phosphorodiamidate morpholino oligo).

Os Morfolinos úsanse xeralmente como ferramentas para a investigación en xenética inversa para interferir na expresión xénica (knockdown) dun determinado xene. Isto conséguese impedíndolles ás células fabricar unha proteína específica [1] ou modificando o splicing do pre-ARNm.[2] Bloquear a expresión xénica é un método moi potente para poder coñecer cal é a función dunha determinada proteína; de maneira similar, facer que un exón epecífico sexa eliminado no splicing pode axudar a determinar a función do residuo proteico codificado nese exón. Estas moléculas utilizáronse tamén en estudos en varios organismos modelo, como o rato, peixe cebra, o sapo Xenopus, e o ourizo de mar.[3]

Os Morfolinos están tamén en desenvolvemento como fármacos terapéuticos dirixidos contra organismos patóxenos como bacterias[4] ou virus[5] e para a mellora de pacientes con doenzas de orixe xenética.[6] Estes oligos sintéticos foron ideados por James E. Summerton (Gene Tools, LLC) e desenvolvidos en colaboración con Dwight D. Weller (AVI BioPharma Inc.).

Estrutura[editar | editar a fonte]

Os Morfolinos son moléculas sintéticas que son o resultado de redeseñar a estrutura dos ácidos nucleicos naturais.[7] Xeralmente teñen unha lonxitude de 25 bases, únense a secuencias complementarias do ARN por emparellamento de bases estándar. Estructuralmente, a diferenza entre os Morfolinos e o ADN é que a pesar de que os Morfolinos teñen as bases estándar dos ácidos nucleicos, ditas bases están unidas a aneis morfolino en lugar de a aneis de desoxirribosa e enlazadas por grupos fosforodiamidato en vez de por fosfatos.[7] Isto pode ser máis fácil de visualizar facendo referencia á primeira figura desta páxina e comparando as estruturas das dúas cadeas mostradas, unha de ARN e a outra de Morfolino. A substitución dos anións fosfato polos grupos fosforodiamidato sen carga elimina a ionización no rango normal do pH fisiolóxico, polo que os Morfolinos nos organismos ou nas células son moléculas non cargadas. O esqueleto completo dun Morfolino está feito destas subunidades modificadas. Os Morfolinos úsanse principalmente como oligos monocatenarios, aínda que poden usarse heterodúplex formados por unha cadea de Morfolino e unha cadea complementaria de ADN en combinación con reactivos catiónicos que facilitan ao seu paso ao citosol.[8]

Función[editar | editar a fonte]

Os Morfolinos non degradan as moléculas de ARN coas que se unen, a diferenza do que fan moitos tipos estruturais antisentido (por exemplo, fosforotioatos, siRNA). Polo contrario, os Morfolinos actúan por "bloqueo estérico", uníndose a determinadas secuencias diana dun ARN e simplemente colocándose no camiño doutras moléculas que poderían doutro modo interactuar co ARN.[1] Os oligos Morfolino utilízanse con frecuencia para investigar a función dun transcrito específico de ARNm nos embrións. Os biólogos que estudan o desenvolvemento embrionario inxectan oligos Morfolino en ovos ou embrións de peixes cebra (Zebra danio),[9] o sapo Xenopus,[10] o ourizo de mar,[11] ou no peixe Fundulus heteroclitus producindo embrións morfantes (morphant, é dicir, coa expresión de xenes bloqueada por tratamento con Morfolinos), ou introducen Morpholinos por electroporación en células de embrións de polo[12] nas súas fases iniciais de desenvolvemento. Usando sistemas apropiados que faciliten o seu paso ao citosol, os Morfolinos poden funcionar nos cultivos celulares[8][13]. Os Morfolinos están sendo desenvolvidos como produtos farmacéuticos co nome de "NeuGenes" por AVI BioPharma Inc. Foron utilizados en mamíferos como o rato[14] e algúns están sendo actualmente probados en ensaios clínicos para o tratamento da distrofia muscular de Duchenne en humanos.[15]

Expresión xenética nomal en eucariotas[editar | editar a fonte]

Artigo principal: Expresión xenética.
Expresión xenética normal en eucariotas, sen intervención de Morfolinos.

Nos eucariotas, o pre-ARNm transcríbese no núcleo, elimínanse os intróns, e despois o ARNm maduro expórtase ao citoplasma. A subunidade menor do ribosoma normalmente se une a un extremo do ARNm e a el únense varios factores de iniciación, formando o complexo de iniciación. O complexo de iniciación desprázase sobre o filamento de ARNm ata que se coloca no codón de iniciación, e despois a subunidade maior do ribosoma xúntase coa menor e empeza a tradución da proteína. A todo este proceso se lle denomina expresión xénica; é o proceso por medio do cal a información dun xene, codificada como unha secuencia de bases do ADN, convértese na secuencia de aminoácidos dunha proteína. Un Morfolino pode modificar o splicing ou bloquear a tradución, dependendo da secuencia de bases do Morfolino.

Bloqueo da tradución[editar | editar a fonte]

Bloqueo da tradución feito por un oligo Morfolino.

Os Morfolinos unidos á rexión 5'UTR dun ARN mensaxeiro poden interferir coa progresión co complexo de iniciación ribosómico desde a carapucha 5' do ARNm ao codón de iniciación. Isto impide a tradución da rexión codificante do transcrito diana (o que se chama "knocking down" da expresión xenética). Isto é moi útil experimentalmente cando se desexa coñecer cal é a función dunha determinada proteína na célula; os Morfolinos proporcionan un medio adecuado para realizar o knockdown da expresión da proteína e descubrir como este cambio afecta á célula ou ao organismo. Algúns Morfolinos bloquean a expresión tan efectivamente que, despois da degradación das proteínas preexistentes, as proteínas obxectivo chegan a ser indetectables pola técnica do Western blot[16].

Modificación do splicing do ARNm[editar | editar a fonte]

Bloqueo do splicing feito por un oligo Morfolino.

Os Morfolinos poden interferir co procesamento do pre-ARNm ou ben impedindo que os complexos de ribonucleoproteinas snRNP que dirixen o splicing se unan ás súas dianas nos inicios dos intróns nun filamento de pre-ARNm, ou ben bloqueando a adenina nucleofílica e impedindo que se forme o lazo lariat do splicing, ou ben interferindo coa unión das proteínas regulatorias do empalme como os silenciadores do empalme[17] e os amplificadores do empalme.[18]. Impedir durante o splicing a unión da snRNP U1 (no sitio doante) ou U2/U5 (no residuo de polipirimidina e sitio aceptor) pode modificar o splicing, normalmente excluíndo exóns do ARNm maduro. Tomando como dianas algúns lugares de empalme pode orixinar a inclusión dun intrón no ARNm maduro, mentres que a activación de sitios ocultos de empalme pode orixinar inclusións ou exclusións parciais.[19] Os sitios de unión das snRNP U11/U12 poden ser bloqueados tamén.[20] A modificación pode ser convenientemente comprobada por transcritase inversa-reacción en cadea da polimerase (RT-PCR) e ponse en evidencia como un cambio de banda despois de facer unha electroforese en xel de produtos RT-PCR.[2]

Bloqueo doutros sitios do ARNm[editar | editar a fonte]

Os Morfolinos utilizáronse tamén para bloquear a actividade de microARN[21][22] e a súa maduración.[23] Poden tamén bloquear a actividade de ribocimas.[24] As funcións das snRNP U2 e U12 poden ser inhibidas con Morfolinos.[25] Os Morfolinos dirixidos contra secuencias de ARNm "escorregadizas" ("slippery") en rexións codificantes de proteínas poden inducir cambios de pauta de lectura durante a tradución.[26] As actividades dos Morfolinos contra toda esta variedade de obxectivos suxire que o Morfolinos poden utilizarse como unha ferramenta de uso xeral para bloquear a interacción de proteínas ou ácidos nucleicos co ARNm.

Especificidade, estabilidade e efectos non antisentido[editar | editar a fonte]

Os Morfolinos convertéronse nunha ferramenta estándar de bloqueo xenético en sistemas embrionarios de animais, os cales presentan un grao de expresión xenética máis amplo ca os tecidos adultos e poden verse moi afectados por interaccións "fóra do obxectivo". Despois das inxeccións iniciais en embrións de ra ou peixes na fase dunha soa célula ou de poucas células, os efectos dos Morpholinos poden medirse ata cinco días máis tarde,[27] despois de que pasaron a maioría dos procesos de organoxénese e diferenciación celular, observándose fenotipos coherentes co bloqueo do xene obxectivo. Oligos de control con secuencias irrelevantes normalmente non producen cambios no fenotipo do embrión, o que é unha proba da especificidade da secuencia dos oligos Morfolinos e da falta de efectos non antisentido. A dose requirida para o bloqueo (knockdown) pode ser reducida pola inxección simultánea de varios oligos Morfolino dirixidos contra o mesmo ARNm, o cal é unha estratexia efectiva para reducir ou eliminar as interaccións con ARN fóra do obxectivo dependentes da dose.[28]

Experimentos de rescate de ARNm poden a miúdo restaurar o fenotipo salvaxe dos embrións e proporcionar probas da especificidade dun Morfolino. Nun rescate de ARNm, inxéctanse simultaneamente un Morfolino e un ARNm que codifica a mesma proteína que o Morfolino debe bloquear. Porén, o ARNm de rescate ten unha rexión 5'-UTR modificada para que o ARNm de rescate non conteña dianas para o Morfolino, pero a rexión codificante do ARNm de rescate si codifica a proteína que interesa. A tradución do ARNm de rescate substitúe a produción da proteína que fora bloqueada polo Morfolino. Como o ARNm de rescate non afecta aos cambios fenotípicos debidos á modulación da expresión xénica fóra do obxectivo feita polo Morfolino, esta volta ao fenotipo salvaxe é unha evidencia adicional da especificidade dos Morfolino.[27]

Debido a teren esqueletos moleculares completamente artificiais, os Morfolinos non son recoñecidos polas proteínas celulares. As nucleases non degradan Morfolinos,[29] nin tampouco son degradados no soro ou nas células.[30] Os Morfolinos non activan receptores de tipo Toll, polo que non activan respostas inmunitarias como a indución do interferón ou a resposta inflamatoria mediada por NF-κB. Os Morfolinos non modifican a metilación do ADN.

Un motivo de preocupación no uso de Morfolinos é o seu potencial de producir efectos "fóra do obxectivo". Ata o 18% dos Morfolinos parecen producir fenotipos fóra do obxectivo, incluíndo a morte celular no sistema nervioso central e tecidos das somitas dos embrións de peixe cebra.[31] A maioría destes efectos parece que se deben á activación da apoptose mediada por p53, e poden ser suprimidos pola inxección simultánea dun Morfolino anti-p53 e do Morfolino experimental.[32] Parece que estes efectos son específicos de secuencia; xa que en moitos casos, se un Morfolino se asocia con efectos fóra do obxectivo, un Morfolino cunha secuencia de 4 bases non complementaria non desencadea estes efectos. A cuestión de se un fenotipo morfante observado se debe ao pretendido bloqueo xenético ou a unha interacción fóra da diana pode ser con frecuencia dilucidada levando a cabo outro experimento para confirmar que o fenotipo morfante observado é un resultado do bloqueo da diana pretendida. Isto pode facerse recapitulando o fenotipo morfante cun segundo Morfolino que non se solape en secuencia dirixido contra o mesmo ARNm[27] ou confirmando os fenotipos observados usando un mutante ou con métodos dominante-negativo. Como se mencionou antes, o rescate de fenotipos observados inxectando simultaneamente un ARNm de rescate é, cando é factible facelo, unha proba fiable da especificidade dun Morfolino.[27]

Entrada na célula[editar | editar a fonte]

Para que un Morfolino sexa efectivo debe penetrar na célula atravesando a membrana celular. Unha vez que están no citosol, os Morfolinos difunden libremente entre o citosol e o núcleo, como se demostra pola actividade de modificación do splicing exhibida polos Morfolinos observada despois da microinxección no citosol das células. Úsanse diferentes métodos para introducilos en embrións, células cultivadas ou en animais adultos. Para a súa introdución en embrións úsase un aparello de microinxección, e as inxeccións realízanse normalmente na fase embrionaria dunha célula ou de poucas células;[33] un método alternativo para a súa introdución en embrións é a electroporación (descargas eléctricas que crean poros na membrana), que pode facilitar a entrada dos oligos nos tecidos de fases embrionarias posteriores.[34] Técnicas comúns para a introdución en células cultivadas son o uso do péptido Endo-Porter (que fai que o Morfolino sexa liberado dos endosomas),[13] o "Sistema Especial" de introdución (que usa un heterodúplex Morfolino-ADN e un axente de penetración polietilenimina etoxilado),[8] a electroporación,[35] ou o scrape loading (carga por raspado).[36]

A introdución en tecidos adultos normalmente é difícil, aínda que hai algúns sistemas que permiten a absorción de oligos Morfolino non modificados (entre os que se inclúen as células musculares, xa de seu moi permeables, características da distrofia muscular de Duchenne[37] ou as células do endotelio vascular estresadas durante unha anxioplastia[38]). Aínda que son permeables aos líquidos intercelulares, os PMOs (Morfolinos) non conxugados distribúense de forma bastante limitada no citosol e núcleo nos tecidos sans cando son administrados por vía IV. A administración sistémica en moitas células nos organismos adultos pode realizarse usando conxugados covalentes dos oligos Morfolino, que levan péptidos penetradores da célula unidos, e, aínda que foi asociada toxicidade co uso de doses moderadas de conxugados de péptidos,[39][40] foron utilizados con efectividade in vivo para a introdución de oligos en doses inferiores ás que causan toxicidade.[5][41] Un dendrímero octa-guanidinio unido ao extremo dun Morfolino pode facer penetrar o oligo modificado (chamado Vivo-Morfolino) desde o sangue ao citosol celular.[42][43] Os Morfolinos con capacidade de penetración, como os conxugados con péptidos ou os Vivo-Morfolinos, son moi prometedores para usos terapéuticos en doenzas virais e xenéticas.[44]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. 1,0 1,1 Summerton, J (1999). "Morpholino Antisense Oligomers: The Case for an RNase-H Independent Structural Type.". Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1): 141–58. PMID 10807004. 
  2. 2,0 2,1 Draper, BW; Morcos, PA, Kimmel, CB (2001). "Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: A quantifiable method for gene knockdown.". Genesis 30 (3): 154–6. DOI:10.1002/gene.1053. PMID 11477696. 
  3. Heasman J (2002). "Morpholino oligos: making sense of antisense?". Dev. Biol. 243 (2): 209–14. DOI:10.1006/dbio.2001.0565. PMID 11884031. 
  4. Geller BL (2005). "Antibacterial antisense". Curr. Opin. Mol. Ther. 7 (2): 109–13. PMID 15844617. 
  5. 5,0 5,1 Deas, TS; Bennett CJ, Jones SA, Tilgner M, Ren P, Behr MJ, Stein DA, Iversen PL, Kramer LD, Bernard KA, Shi PY (2007). "In vitro resistance selection and in vivo efficacy of morpholino oligomers against West Nile virus.". Antimicrob Agents Chemother. 51 (7): 2470. DOI:10.1128/AAC.00069-07. PMC 1913242. PMID 17485503. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1913242. 
  6. McClorey, G; Fall AM, Moulton HM, Iversen PL, Rasko JE, Ryan M, Fletcher S, Wilton SD (2006). "Induced dystrophin exon skipping in human muscle explants.". Neuromuscul Disord. 16 (9-10): 583–90. DOI:10.1016/j.nmd.2006.05.017. PMID 16919955. 
  7. 7,0 7,1 Summerton, J; Weller D (1997). "Morpholino Antisense Oligomers: Design, Preparation and Properties.". Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7* (3): 187–95. PMID 9212909. 
  8. 8,0 8,1 8,2 Morcos, PA (2001). "Achieving efficient delivery of morpholino oligos in cultured cells.". Genesis 30 (3): 94–102. DOI:10.1002/gene.1039. PMID 11477682. 
  9. Nasevicius, A; Ekker SC (2000). "Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.". Nature Genetics 26 (2): 216–20. DOI:10.1038/79951. PMID 11017081. 
  10. Heasman, J; Kofron M, Wylie C (2000). "Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.". Developmental Biology 222 (1): 124–34. DOI:10.1006/dbio.2000.9720. PMID 10885751. 
  11. Howard, EW; Newman LA, Oleksyn DW, Angerer RC, Angerer LM (2001). "SpKrl: a direct target of (beta)-catenin regulation required for endoderm differentiation in sea urchin embryos.". Development 128 (3): 365–75. PMID 11152635. 
  12. Kos, R; Reedy MV, Johnson RL, Erickson CA (2001). "The winged-helix transcription factor FoxD3 is important for establishing the neural crest lineage and repressing melanogenesis in avian embryos.". Development 128 (8): 1467–79. PMID 11262245. 
  13. 13,0 13,1 Summerton, JE (2005). "Endo-porter: a novel reagent for safe, effective delivery of substances into cells.". Ann N Y Acad Sci. 1058: 62–75. DOI:10.1196/annals.1359.012. PMID 16394126. 
  14. Coonrod, SA; Bolling LC, Wright PW, Visconti PE, Herr JC (2001). "A morpholino phenocopy of the mouse MOS mutation.". Genesis 30 (3): 198–200. DOI:10.1002/gene.1065. PMID 11477708. 
  15. http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01396239
  16. Stancheva, I; Collins AL, Van den Veyver IB, Zoghbi H, Meehan RR (2003). "A mutant form of MeCP2 protein associated with human Rett syndrome cannot be displaced from methylated DNA by notch in Xenopus embryos.". Mol Cell 12 (2): 425–35. DOI:10.1016/S1097-2765(03)00276-4. PMID 14536082. 
  17. Bruno, IG; Jin W, Cote GJ (2004). "Correction of aberrant FGFR1 alternative RNA splicing through targeting of intronic regulatory elements.". Hum Mol Genet 3 (20): 2409–20. DOI:10.1093/hmg/ddh272. PMID 15333583. 
  18. Vetrini, F; Tammaro R, Bondanza S, Surace EM, Auricchio A, De Luca M, Ballabio A, Marigo V (2006). "Aberrant splicing in the ocular albinism type 1 gene (OA1/GPR143) is corrected in vitro by morpholino antisense oligonucleotides.". Hum Mutat 27 (5): 420–6. DOI:10.1002/humu.20303. PMID 16550551. 
  19. Morcos, PA (2007). "Achieving targeted and quantifiable alteration of mRNA splicing with Morpholino oligos.". Biochem Biophys Res Commun 358 (2): 521. DOI:10.1016/j.bbrc.2007.04.172. PMID 17493584. 
  20. König, H; Matter N, Bader R, Thiele W, Müller F (2007). "Splicing Segregation: The Minor Spliceosome Acts outside the Nucleus and Controls Cell Proliferation.". Cell 131 (4): 718–29. DOI:10.1016/j.cell.2007.09.043. PMID 18022366. 
  21. Kloosterman, WP; Wienholds E, Ketting RF, Plasterk RH (2004). "Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo.". Nucleic Acids Res 32 (21): 6284–91. DOI:10.1093/nar/gkh968. PMC 535676. PMID 15585662. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=535676. 
  22. Flynt, AS; Li N, Thatcher EJ, Solnica-Krezel L, Patton JG (2007). "Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate.". Nature Genetics 39 (2): 259–263. DOI:10.1038/ng1953. PMID 17220889. 
  23. Kloosterman, WP; Lagendijk AK, Ketting RF, Moulton JD, Plasterk RHA (2007). "Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development.". PLoS Biol. 5 (8): e203. DOI:10.1371/journal.pbio.0050203. PMC 1925136. PMID 17676975. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1925136. 
  24. Yen, L; Svendsen J, Lee JS, Gray JT, Magnier M, Baba T, D'Amato RJ, Mulligan RC (2004). "Exogenous control of mammalian gene expression through modulation of RNA self-cleavage.". Nature 431 (7007): 471–6. DOI:10.1038/nature02844. PMID 15386015. 
  25. Matter, N; Konig H (2005). "Targeted 'knockdown' of spliceosome function in mammalian cells.". Nucleic Acids Res 33 (4): e41. DOI:10.1093/nar/gni041. PMC 549580. PMID 15731334. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=549580. 
  26. Howard, MT; Gesteland RF, Atkins JF* (2004). "Efficient stimulation of site-specific ribosome frameshifting by antisense oligonucleotides.". RNA 10 (10): 1653–61. DOI:10.1261/rna.7810204. PMC 1370650. PMID 15383681. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1370650. 
  27. 27,0 27,1 27,2 27,3 Bill, BR; Petzold AM, Clark KJ, Schimmenti LA, Ekker SC (2009). "A primer for morpholino use in zebrafish". Zebrafish 6 (1): 69–77. DOI:10.1089/zeb.2008.0555. PMC 2776066. PMID 19374550. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=2776066. 
  28. Kamachi, Y; Okuda Y, Kondoh H (2008). "Quantitative Assessment of the Knockdown Efficiency of Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos Using a Luciferase Assay". Genesis 46 (1): 1–7. DOI:10.1002/dvg.20361. PMID 18196596. 
  29. Hudziak, RM; Barofsky E, Barofsky DF, Weller DL, Huang SB, Weller DD (1996). "Resistance of morpholino phosphorodiamidate oligomers to enzymatic degradation.". Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6 (4): 267–72. PMID 9012862. 
  30. Youngblood, DS; Hatlevig SA, Hassinger JN, Iversen PL, Moulton HM (2007). "Stability of cell-penetrating peptide-morpholino oligomer conjugates in human serum and in cells.". Bioconjug Chem. 18 (1): 50–60. DOI:10.1021/bc060138s. PMID 17226957. 
  31. Ekker, SC; Larson JD (2001). "Morphant Technology in Model Developmental Systems.". Genesis 30 (3): 89–93. DOI:10.1002/gene.1038. PMID 11477681. 
  32. Robu, ME; Larson JD, Nasevicius A, Beiraghi S, Brenner C, Farber SA, Ekker SC (2007). "p53 activation by knockdown technologies.". PLoS Genetics 3 (5): e78. DOI:10.1371/journal.pgen.0030078. PMC 1877875. PMID 17530925. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1877875. 
  33. Rosen, JN; Sweeny MF, Mably JD (2009). "Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.". J Vis Exp. 9 (25). DOI:10.3791/1115. PMID 19274045. http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1115. 
  34. Cerda, GA; Thomas JE, Allende ML, Karlstrom RO, Palma V (2006). "Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.". Methods 39 (3): 207–11. DOI:10.1016/j.ymeth.2005.12.009. PMID 16837210. 
  35. Jubin, R (2004). "Optimizing electroporation conditions for intracellular delivery of morpholino antisense oligonucleotides directed against the hepatitis C virus internal ribosome entry site.". Methods Mol Med. 106: 309–22. PMID 15375324. 
  36. Partridge, M; Vincent A, Matthews P, Puma J, Stein D, Summerton J (1996). "A simple method for delivering morpholino antisense oligos into the cytoplasm of cells.". Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6 (3): 169–75. PMID 8915501. 
  37. Fletcher, S; Honeyman K, Fall AM, Harding PL, Johnsen RD, Wilton SD (2006). "Dystrophin expression in the mdx mouse after localised and systemic administration of a morpholino antisense oligonucleotide.". J Gene Med. 8 (2): 207–16. DOI:10.1002/jgm.838. PMID 16285002. 
  38. Kipshidze, NN; Kim HS, Iversen P, Yazdi HA, Bhargava B, New G, Mehran R, Tio F, Haudenschild C, Dangas G, Stone GW, Iyer S, Roubin GS, Leon MB, Moses JW (2002). "Intramural coronary delivery of advanced antisense oligonucleotides reduces neointimal formation in the porcine stent restenosis model.". J Am Coll Cardiol. 39 (10): 1686–91. DOI:10.1016/S0735-1097(02)01830-2. PMID 12020498. 
  39. Abes, S; Moulton HM, Clair P, Prevot P, Youngblood DS, Wu RP, Iversen PL, Lebleu B (2006). "Vectorization of morpholino oligomers by the (R-Ahx-R)(4) peptide allows efficient splicing correction in the absence of endosomolytic agents.". J Control Release 116 (3): 304–13. DOI:10.1016/j.jconrel.2006.09.011. PMID 17097177. 
  40. Burrer, R; Neuman BW, Ting JPC, Stein DA, Moulton HM, Iversen PL, Kuhn P, Buchmeier MJ (2007). "Antiviral effects of antisense morpholino oligomers in murine coronavirus infection models.". J. Virol. 81 (11): 5637–48. DOI:10.1128/JVI.02360-06. PMC 1900280. PMID 17344287. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1900280. 
  41. Amantana, A; Moulton HM, Cate ML, Reddy MT, Whitehead T, Hassinger JN, Youngblood DS, Iversen PL (2007). "Pharmacokinetics, Biodistribution, Stability and Toxicity of a Cell-Penetrating Peptide-Morpholino Oligomer Conjugate.". Bioconjug Chem 18 (4): 1325. DOI:10.1021/bc070060v. PMID 17583927. 
  42. Li, YF; Morcos PA (2008). "Design and Synthesis of Dendritic Molecular Transporter that Achieves Efficient in Vivo Delivery of Morpholino Antisense Oligo.". Bioconjug Chem 19 (7): 1464–70. DOI:10.1021/bc8001437. PMID 18564870. 
  43. Morcos, PA; Li YF, Jiang S (2008). "Vivo-Morpholinos: A non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues". BioTechniques 45 (6): 616–26. DOI:10.2144/000113005. http://www.biotechniques.com/default.asp?page=current&subsection=article_display&id=113005. 
  44. Moulton, JD; Jiang S (2009). "Gene Knockdowns in Adult Animals: PPMOs and Vivo-Morpholinos". Molecules 14 (3): 1304–23. DOI:10.3390/molecules14031304. PMID 19325525. http://www.mdpi.com/1420-3049/14/3/1304. 

Outras lecturas[editar | editar a fonte]

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artigos[editar | editar a fonte]