Knock-in de xenes

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Saltar ata a navegación Saltar á procura

En bioloxía molecular e bioloxía, un knock-in de xenes (ou knock-in) é un método de enxeñaría xenética que implica a substitución unha a unha de información de secuencia de ADN nun locus xenético ou a inserción de información de secuencia que non se encontraba nese locus.[1] Normalmente isto faise en ratos, xa que a tecnoloxía para este proceso é máis refinada neles e hai un alto grao de complexidade de secuencias compartidas entre ratos e humanos.[2] A diferenza entre a tecnoloxía knock-in e as técnicas transxénicas tradicionais é que un knock-in afecta a un xene nun locus específico, polo que é unha inserción dirixida a unha diana.

Un uso común da tecnoloxía knock-in é para a creación de modelos de enfermidades. É unha técnica grazas á que os investigadores poden estudar a función da maquinaria reguladora (por exemplo, promotores) que goberna a expresión do xene natural que está sendo substituído. Isto realízase observando o novo fenotipo do organismo en cuestión. Utilízanse BACs e YACs para que se poidan transferir grandes fragmentos.

Técnica[editar | editar a fonte]

O knock-in de xenes orixinouse como unha pequena modificación da técnica orixinal do knockout desenvolvida por Martin Evans, Oliver Smithies e Mario Capecchi. Tradicionalmente, as técnicas knock-in fundamentábanse na recombinación homóloga para dirixir a substitución do xene diana, aínda que se desenvolveron tamén outros métodos que usan un sistema mediado por transposóns.[3] As células nai embrionarias coa modificación de interese son implantadas despois nun blastocisto viable, que crecerá formando un rato quimérico maduro, no cal algunhas células teñen a información xenética das células do blastocisto orixinal e outras células teñen as modificacións introducidas nas células nai embrionarias. A descendencia que teñan despois eses ratos quiméricos terá o knock-in.[4]

O knock-in de xenes permitiu por primeira vez facer estudos baseados en hipóteses sobre modificacións xénicas e os fenotipos resultantes. Por exemplo, poden inducirse mutacions no xene humano p53 por exposición ao benzo(a)pireno (BaP), e a copia mutada do xene p53 pode ser inserida en xenomas de rato. Os tumores pulmonares observados nos ratos knock-in ofrecen apoio á hipótese da carcinoxenicidade do benzo(a)pireno (un compoñente do fume do tabaco).[5] Desenvolvementos máis recentes nas técnicas knock-in permitiron incorporar nos porcos un xene da proteína fluorescente verde inserida co sistema CRISPR/Cas9, que permite unhas insercións xénicas máis exactas e exitosas.[6] A velocidade do knock-in de xenes mediado por CRISPR/Cas9 tamén permite xerar modificacións bialélicas nalgúns xenes e os fenotipos en ratos poden ser observados nunha soa xeración, o que é unha curta escala de tempo sen precedentes.[7]

Comparación co knockout de xenes[editar | editar a fonte]

A tecnoloxía knock-in é distinta da knockout porque a tecnoloxía knockout trata de eliminar por deleción parte da secuencia de ADN ou inserir información de secuencia de ADN irrelevante para interromper a expresión dun locus xenético específico. A tecnoloxía knock-in, por outra parte, altera o locus xenético de interese por medio dunha substitución unha a unha da información de secuencia de ADN ou pola adición de información de secuencia que non se encontrba en dito locus xenético. Un knock-in, por tanto, pode considerarse en xeral unha mutación de ganancia de función e un knockout unha mutación de perda de función, pero un knock-in de xenes pode tamén implicar a substitución dun locus xénico funcional por un fenotipo mutante que ten como resultado algunha perda de función.[8]

Posibles aplicacións[editar | editar a fonte]

Debido do éxito que están tendo os métodos de knock-in, pode pensarse para eles moitas aplicacións clínicas. O knock-in de seccións dun xene de inmunoglobulina humana en ratos xa permitiu que estes animais produzan anticorpos humanizados que son útiles terapeuticamente.[9] Debería ser posible modificar células nai en humanos para restaurar a función dun xene diana en certos tecidos, por exemplo a posible corrección do xene mutante da cadea gamma do receptor de IL-2 en células nai hematopoéticas para estaurar o desenvolvemento dos linfocitos en persoas con inmunodeficiencia combinada grave ligada ao X.[4]

Limitacións[editar | editar a fonte]

Aínda que a tecnoloxía do knock-in demostrou ser poderosa para a xeración de modelos de enfermidades humanas e estudo de proteínas in vivo, existen aínda numerosas limitacións. Moitas destas son as mesmas que ten a tecnoloxía knockout. Primeiro, as combinacións de xenes knock-in levan a un crecemento da complexidade nas interaccións que teñen os xenes inseridos e os seus produtos con outras seccións do xenoma e poden, por tanto, conducir á aparición de máis efectos colaterais e fenotipos difíciles de explicar. Ademais, só foron suficientemente ben caracterizados uns poucos loci, como o locus ROSA26, onde poden utilizarse para o knock-in de xenes condicional; facendo combinacións de xene reporteiro e transxenes no mesmo locus problemático. As maiores desvantaxes de usar o knock-in de xenes en enfermidades humanas para xerar modelos é que a fisiololxía dos ratos non é idéntica á humana e as proteínas ortólogas humanas expresadas en ratos adoitan non reflectir totalmente o papel dun xene na patoloxía humana.[10] Isto pode observarse en ratos producidos coa mutación da fibrose ΔF508 no xene CFTR, que explica máis do 70% das mutacións neste xene na poboación humana e orixina fibrose quística. Aínda que os ratos ΔF508 CF mostran as características de defectos de procesamento propias da mutación humana, non presentan os cambios na fisiopatoloxía pulmonar que se observan en humanos e non presentan virtualmente ningún fenotipo pulmonar.[11] Estes problemas poden ser mitigados co uso de diversos modelos animais, e creáronse modelos de porcos (os pulmóns de porco teñen moitas semellanzas bioquímicas e fisioloxicas cos pulmóns humanos) nun intento de explicar mellor a actividade da mutación ΔF508.[12]

Notas[editar | editar a fonte]

  1. Gibson, Greg (2009). A Primer Of Genome Science 3rd ed. Sunderland, Massachusetts: Sinauer. pp. 301–302. ISBN 978-0-87893-236-8. 
  2. Mouse Genome Sequencing Consortium; Waterston, Robert H.; Lindblad-Toh, Kerstin; Birney, Ewan; Rogers, Jane; Abril, Josep F.; Agarwal, Pankaj; Agarwala, Richa; Ainscough, Rachel (2002-1-05). "Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome". Nature 420 (6915): 520–562. ISSN 0028-0836. PMID 12466850. doi:10.1038/nature01262. 
  3. Westphal, C. H.; Leder, P. (1997-07-01). "Transposon-generated 'knock-out' and 'knock-in' gene-targeting constructs for use in mice". Current Biology 7 (7): 530–533. ISSN 0960-9822. PMID 9210379. doi:10.1016/s0960-9822(06)00224-7. 
  4. 4,0 4,1 Manis, John P. (2007-12-13). "Knock out, knock in, knock down--genetically manipulated mice and the Nobel Prize". The New England Journal of Medicine 357 (24): 2426–2429. ISSN 1533-4406. PMID 18077807. doi:10.1056/NEJMp0707712. 
  5. Liu, Zhipei; Muehlbauer, Karl-Rudolf; Schmeiser, Heinz H.; Hergenhahn, Manfred; Belharazem, Djeda; Hollstein, Monica C. (2005-04-01). "p53 mutations in benzo(a)pyrene-exposed human p53 knock-in murine fibroblasts correlate with p53 mutations in human lung tumors". Cancer Research 65 (7): 2583–2587. ISSN 0008-5472. PMID 15805253. doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-3675. 
  6. Ruan, Jinxue; Li, Hegang; Xu, Kui; Wu, Tianwen; Wei, Jingliang; Zhou, Rong; Liu, Zhiguo; Mu, Yulian; Yang, Shulin (2015-09-18). "Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs". Scientific Reports (en inglés) 5: 14253. PMC 4585612. PMID 26381350. doi:10.1038/srep14253. 
  7. Wang, Yanliang; Li, Junhong; Xiang, Jinzhu; Wen, Bingqiang; Mu, Haiyuan; Zhang, Wei; Han, Jianyong (2015-12-10). "Highly efficient generation of biallelic reporter gene knock-in mice via CRISPR-mediated genome editing of ESCs". Protein & Cell (en inglés) 7 (2): 152–156. ISSN 1674-800X. PMC 4742388. PMID 26661644. doi:10.1007/s13238-015-0228-3. 
  8. Doyle, Alfred; McGarry, Michael P.; Lee, Nancy A.; Lee, James J. (2012-04-01). "The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease". Transgenic Research 21 (2): 327–349. ISSN 0962-8819. PMC 3516403. PMID 21800101. doi:10.1007/s11248-011-9537-3. 
  9. Benatuil, Lorenzo; Kaye, Joel; Cretin, Nathalie; Godwin, Jonathan G.; Cariappa, Annaiah; Pillai, Shiv; Iacomini, John (2008-03-15). "Ig knock-in mice producing anti-carbohydrate antibodies: breakthrough of B cells producing low affinity anti-self antibodies". Journal of Immunology 180 (6): 3839–3848. ISSN 0022-1767. PMID 18322191. doi:10.4049/jimmunol.180.6.3839. 
  10. Tellkamp, Frederik; Benhadou, Farida; Bremer, Jeroen; Gnarra, Maria; Knüver, Jana; Schaffenrath, Sandra; Vorhagen, Susanne (2014-12-01). "Transgenic mouse technology in skin biology: generation of knockin mice". The Journal of Investigative Dermatology 134 (12): 1–3. ISSN 1523-1747. PMID 25381772. doi:10.1038/jid.2014.434. 
  11. Grubb, Barbara R.; Boucher, Richard C. (1999-01-01). "Pathophysiology of Gene-Targeted Mouse Models for Cystic Fibrosis". Physiological Reviews (en inglés) 79 (1): S193–S214. ISSN 0031-9333. PMID 9922382. doi:10.1152/physrev.1999.79.1.S193. 
  12. Rogers, Christopher S.; Hao, Yanhong; Rokhlina, Tatiana; Samuel, Melissa; Stoltz, David A.; Li, Yuhong; Petroff, Elena; Vermeer, Daniel W.; Kabel, Amanda C. (2008-04-01). "Production of CFTR-null and CFTR-DeltaF508 heterozygous pigs by adeno-associated virus-mediated gene targeting and somatic cell nuclear transfer". The Journal of Clinical Investigation 118 (4): 1571–1577. ISSN 0021-9738. PMC 2265103. PMID 18324337. doi:10.1172/JCI34773. 

Véxase tamén[editar | editar a fonte]

Outros artighos[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas[editar | editar a fonte]