ADN recombinante: Diferenzas entre revisións

Na Galipedia, a Wikipedia en galego.
Explorar o historial de forma interactiva
← Edición máis vellaEdición máis nova →
Contido eliminado Contido engadido
VisualTexto wiki
Miguelferig (conversa | contribucións)
241.924 edicións
Miguelferig (conversa | contribucións)
241.924 edicións
Liña 195: Liña 195:
| url = https://zenodo.org/record/1233343
| url = https://zenodo.org/record/1233343
}}</ref>
}}</ref>
⚫
-->

== Historia ==
== Historia ==


Liña 281: Liña 281:
== Polémica ==
== Polémica ==


Scientists associated with the initial development of recombinant DNA methods recognized that the potential existed for organisms containing recombinant DNA to have undesirable or dangerous properties. At the 1975 [[Asilomar Conference on Recombinant DNA]], these concerns were discussed and a voluntary moratorium on recombinant DNA research was initiated for experiments that were considered particularly risky. This moratorium was widely observed until the National Institutes of Health (USA) developed and issued formal guidelines for rDNA work. Today, recombinant DNA molecules and recombinant proteins are usually not regarded as dangerous. However, concerns remain about some organisms that express recombinant DNA, particularly when they leave the laboratory and are introduced into the environment or food chain. These concerns are discussed in the articles on [[genetically modified organism]]s and [[genetically modified food controversies]]. Furthermore, there are concerns about the by-products in biopharmaceutical production, where recombinant DNA result in specific protein products. The major by-product, termed [[host cell protein]], comes from the host expression system and poses a threat to the patient's health and the overall environment.<ref>{{Cite journal|last1=Wang|first1=Xing|last2=Hunter|first2=Alan K.|last3=Mozier|first3=Ned M.|date=2009-06-15|title=Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment|journal=Biotechnology and Bioengineering|language=en|volume=103|issue=3|pages=446–458|doi=10.1002/bit.22304|pmid=19388135|issn=0006-3592}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Bracewell|first1=Daniel G.|last2=Francis|first2=Richard|last3=Smales|first3=C. Mark|date=2015-07-14|title=The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control|journal=Biotechnology and Bioengineering|language=en|volume=112|issue=9|pages=1727–1737|doi=10.1002/bit.25628|issn=0006-3592|pmc=4973824|pmid=25998019}}</ref>
Os científicos asociados co desenvolvemento inicial dos métodos do ADN recombinante recoñeceron que existía a posibilidade de que os organismos que contiñan ADN recombinante adquirisen propiedades indesexadas. En 1975 na [[Conferencia de Asilomar sobre ADn recombinante]] discutíronse estas cuestións e iniciouse unha moratoria voluntaria nas investigacións sobre ADN recombinante para aqueles experimentos que eran considerados especialmente perigosos. Esta moratoria foi amplamente obsevada ata que o [[Institutos Nacionais da Saúde]] (EUA) desenvolveron e sacaron unha serie de directrices formais para traballar co ADN recombinante. Hoxe, as moléculas de ADN recombinante e as proetínas recombinantes xeralmente non se consideran perigosas. Porén, segue habendo certa preocupación sobre os organismos que expresan ADN recombinante, especialmente cando son sacados do laboratorio e introducidos no medio ambiente ou na cadea alimentaria. Ademais, preocupan os subprodutos da produción biofarmacéutica, nos que o ADN recombinante orixina proteínas específicas. O principal subproduto, denominado [[proteína da célula hóspede]], procde dun sistema de expresión do hóspede e supón unha ameaza para a saúde do paciente e o medio ambiente global.<ref>{{Cite journal|last1=Wang|first1=Xing|last2=Hunter|first2=Alan K.|last3=Mozier|first3=Ned M.|date=2009-06-15|title=Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment|journal=Biotechnology and Bioengineering|language=en|volume=103|issue=3|pages=446–458|doi=10.1002/bit.22304|pmid=19388135|issn=0006-3592}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Bracewell|first1=Daniel G.|last2=Francis|first2=Richard|last3=Smales|first3=C. Mark|date=2015-07-14|title=The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control|journal=Biotechnology and Bioengineering|language=en|volume=112|issue=9|pages=1727–1737|doi=10.1002/bit.25628|issn=0006-3592|pmc=4973824|pmid=25998019}}</ref>
⚫
-->


== Notas ==
== Notas ==

Revisión como estaba o 6 de setembro de 2020 ás 19:05

Construción dun ADN recombinante, no cal un fragmento de ADN alleo insírese nun plásmido que funciona como vector. Neste exemplo, o xene indicado pola cor branca é inactivado pola inserción do fragmento de ADN alleo.

O ADN recombinante (ADNr ou rDNA, pero isto tamén se usa para o ADN dos xenes do ARN ribosómico) é unha molécula de ADN formada por medio de métodos de laboratorio de recombinación xenética (como a clonación molecular) na que se xuntan materiais xenéticos de dúas ou máis fontes, creando secuencias de ADN que doutro modo non formarían parte do xenoma.

O ADN recombinante é posible porque as moléculas de ADN de todos os organismos comparten a mesma estrutura química e só difiren na secuencia de nucleótidos dentro dunha mesma estrutura global. As moléculas de ADN recombinante denomínanse ás veces ADN quimérico, porque poden facerse con material de dúas especies, como as míticas quimera. A tecnoloxía do ADN recombinante usa secuencias palindrómicas e produce extremos coherentes ou romos no ADN.

As secuencias de ADN usadas na construción de moléculas de ADN recombinante poden proceder de calquera especie. Por exemplo, ADN dunha planta pode unirse con ADN bacteriano, ou ADN humano con ADN de fungo. Ademais, poden crearse secuencias de ADN que non aparecen en ningunha parte na natureza por síntese química de ADN e despois poden incorporarse ás moléculas recombinantes. Couso da tecnoloxía do ADN recombinante e do ADN sintético, literalmente pode crfearse calquera secuencia de ADN e introducida nunha ampla variedade de organismos vivos.

As proteínas que poden orixinarse da expresión dun ADN recombinante nas células vivas denomínanse proteínas recombinantes. Cando o ADN recombinante que codifica proteínas se introduce nun organismo hóspede, non necesariamente se vai producir a proteína recombinante.[1] A expresión de proteínas alleas require o uso de vectores de expresión especializados e adoita necesitar unha significativa reestruturación por secuencias codificantes alleas.[2]

O ADN recombinante é distinto da recombinación xenética porque a primeira se orixina por medios artificiais no tubo de ensaio, mentres que a última é un proceso biolóxico normal no que se remesturan secuencias de ADN xa existentes dentro dun organismo.

Creación

Artigo principal: Clonación molecular.

A clonación molecular é o método de laboratorio usado para crear ADN recombinante.[3][4][5][6] É un dos dosu métodos máis amplamente usados, xunto coa reacción en cadea da polimerase (PCR), usada para dirixir a replicación de calquera secuencia específica de ADN desexada. Hai dúas diferenzas fundamentais entre os dous métidos. Unha é que a clonación molecular implica a replicación do ADN dentro dunha célula viva, mentres que a PCR replica o ADN nun tubo de ensaio, sen células vivas. Outra diferenza é que a clonación implica cortar e pegar secuencias de ADN, mentres que a PCR amplifica copiándoa unha secuencia existente.

A formación do ADN recombinante require un vector de clonación, unha molécula de ADN que leve o ADN ao interior da célula viva. Os vectores xeralmente derivan de plásmidos ou virus e son segmentos relativamente pequenos de ADN que conteñen os sinais xenéticos necesarios para a replicación, así como elementos adicionais convenientes no ADN alleo inserido, que identifican as células que conteñen o ADN recombinante e, cando é apropiado, expresan o ADN alleo. A elección do vector para unha clonación molecular depende do organismo hóspede utilizado, o tamaño do ADN que vai ser clonado e de se o ADn alleo vai ser expresado e como.[7] Os segmentos de ADN poden combinarse usando unha variedade de métodos, como a clonación con encimas de restrición/ligases ou a ensamblaxe de Gibson.

Nos protocolos de clonación estándar, a clonación dun fragmento de ADN implica esencialmente sete pasos: (1) Elección do organismo hóspede e do vector de clonación, (2) Preparación do ADN vector, (3) Preparación do ADN que vai ser clonado, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introdución do ADN recombinante no organismo hóspede, (6) Selección dos organismos que conteñen o ADN recombinante e (7) Cribado buscando os clons co ADN desexado inserido e as súas propiedades biolóxicas.[6] (Para máis detalle ver clonación molecular).

Expresión

Artigo principal: Produción de proteínas.

Despois de transplantalo ao organismo hóspede, o ADn alleo contido no contruto do ADN recombinante pode ser expresado ou non. É dicir, o ADN pode simplemente replicarse sen expresarse ou pode ser transcrito e traducido e acaba orixinando unha proteína recombinante. Xeralmente, a expresión dun xene alleo require a reestruturación do xene para que inclúa secuencias que son necesarias para a produción da molécula de ARNm que servirá para a tradución (por exemplo, un promotor, un sinal de iniciación da tradución e un terminador da transcrición).[8] Poden facerse cambio espacíficos no organismo hóspede para mellorar a expresión do xene ectópico. Ademais, os cambios pode ser necesarios nas secuencias codificantes tamén, para optimizar a tradución, facer que a proteína sexa soluble, dirixir a proteína recombinante á unha localización celular ou extracelular axeitada e estabilizar a proteína ante a súa posible degradación.[9][10]

Propiedades dos organismos que conteñen ADN recombinante

Na maioría dos casos, os organismos que conteñen ADN recombinante teñen aparentemente fenotipos normais. É dicir, a súa aparencia, comportamento e metabolismo non son normalmente cambiados e o único modo de demostrar a presenza de secuencias recombianntes é examinar o propio ADN, normalmente usando un test de PCR.[11] Hai tamén excepcións significativas, que se discuten máis abaixo.

Se as secuencias de ADN recombinante codifican un xene que se expresa, entón pode detectarse a presenza de ARN e/ou produtos proteicos do xene recombinante, xeralmente usando as técnicas da RT-PCR ou do western blot.[11] Os cambios fenotípicos grandes non son o normal, a non sder que o xene recombinante fose elixido e modificado para xerar unha actividade biolóxica no organismo hóspede.[12] Os fenotipos adicionais que se poden encontrar son toxicidade no organismo hóspede inducida polo produto recombinante, especialmente se este é sobreexpresado ou expresado en células ou tecidos inapropiados.

Nalgúns casos, o ADN recombinante pode ter efectos deletéreos incluso se non é expresado. Un mecanismo polo cal pode ocorrer isto é a inactivación inseccional, na cal o ADN recombinante queda inserido nun xene da célula hóspede. Nalgúns casos, pode utilizarse este fenómeno para facer un knockout de xenes para determinar a súa función biolóxica e importancia.[13] Outro mecanismo polo cal a inserción do ADN recombinante no ADN cromosómico pode afectar á expresión xénica é pola inactivación inapropiada de xenes da célula hóspede que previamente non se expresaban. Isto pode acontecer, por exemplo, cando un fragmento de ADN recombinante que contén un promotor activo queda localizado pretotdun xene da célula hóspede previamente silencioso ou cando un xene da célula hóspede que funciona restrinxindo a expresión xénica sofre unha inactivación insercional polo ADN recombinante.

Usos

Historia

A idea dun ADN recombinante foi proposta primeiramenre por Peter Lobban, un estudante graduado do Prof. Dale Kaiser no Departamento de Bioquímica da Escola de Medicina da Un iversidade de Stanford.[14] A primeira publicación que describía a produción con éxito e a replicac ión intracelular de ADN recombinante apareceu en 1972 e 1973, na Universidade de Stanford e na UCSF.[15][16][17][18] En 1980 Paul Berg, un profesor do Departamento de Bioquímica en Stanford e autor dun dos primeiros artigos [15] foi galardoado co Premio Nobel de Química polo seu traballo sobre ácidos nucleicos "con especial consideración ao ADN recombinante". Werner Arber, Hamilton Smith e Daniel Nathans compartiron en 1978 o Premio Noble de Medicina polo descubrimento das endonucleases de restrición, que melloraron as técnicas datecnoloxía do ADN recombinante.

A Universidade de Stanford solicitou unha patente nos Estados Unidos sonre o ADN recombinante en 1974, mencionando como inventores a Herbert W. Boyer (profesor da University de California, San Francisco) e a Stanley N. Cohen (profesor en Stanford); esta patente foi concedida en 1980.[19] O primeiro fármaco que recibiu licenza xerado usando a tecnoloxía do ADN recombinante foi a insulina humana, desenvolvida por Genentech e con licenza de Eli Lilly and Company.[20]

Polémica

Os científicos asociados co desenvolvemento inicial dos métodos do ADN recombinante recoñeceron que existía a posibilidade de que os organismos que contiñan ADN recombinante adquirisen propiedades indesexadas. En 1975 na Conferencia de Asilomar sobre ADn recombinante discutíronse estas cuestións e iniciouse unha moratoria voluntaria nas investigacións sobre ADN recombinante para aqueles experimentos que eran considerados especialmente perigosos. Esta moratoria foi amplamente obsevada ata que o Institutos Nacionais da Saúde (EUA) desenvolveron e sacaron unha serie de directrices formais para traballar co ADN recombinante. Hoxe, as moléculas de ADN recombinante e as proetínas recombinantes xeralmente non se consideran perigosas. Porén, segue habendo certa preocupación sobre os organismos que expresan ADN recombinante, especialmente cando son sacados do laboratorio e introducidos no medio ambiente ou na cadea alimentaria. Ademais, preocupan os subprodutos da produción biofarmacéutica, nos que o ADN recombinante orixina proteínas específicas. O principal subproduto, denominado proteína da célula hóspede, procde dun sistema de expresión do hóspede e supón unha ameaza para a saúde do paciente e o medio ambiente global.[21][22]

Notas

  1. ↑ Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo A. (2014-04-17). "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges". Frontiers in Microbiology 5: 172. ISSN 1664-302X. PMC 4029002. PMID 24860555. doi:10.3389/fmicb.2014.00172. 
  2. ↑ "Promoters used to regulate gene expression". www.cambia.org. Consultado o 16 February 2018. 
  3. ↑ Campbell, Neil A. & Reece, Jane B.. (2002). Biology (6th ed.). San Francisco: Addison Wesley. pp. 375–401. ISBN 978-0-201-75054-6. 
  4. ↑ Peter Walter; Alberts, Bruce; Johnson, Alexander S.; Lewis, Julian; Raff, Martin C.; Roberts, Keith (2008). Molecular Biology of the Cell (5ª edición, ampliada). New York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4111-6. . A 4ª edición está dispoñible en liña no NCBI Bookshelf: link
  5. ↑ Berg, Jeremy Mark; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert (2010). Biochemistry, 7th ed. (Biochemistry (Berg)). W.H. Freeman & Company. ISBN 978-1-4292-2936-4.  A 5ª edición estañ dispoñible en liña no NCBI Bookshelf: link
  6. ↑ 6,0 6,1 Watson, James D. (2007). Recombinant DNA: Genes and Genomes: A Short Course. San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 978-0-7167-2866-5. 
  7. ↑ Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 978-0-87969-576-7.  Parámetro descoñecido |url-access= ignorado (Axuda)
  8. ↑ Hannig, G.; Makrides, S. (1998). "Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli". Trends in Biotechnology 16 (2): 54–60. PMID 9487731. doi:10.1016/S0167-7799(97)01155-4. 
  9. ↑ Brondyk, W. H. (2009). "Chapter 11 Selecting an Appropriate Method for Expressing a Recombinant Protein". Guide to Protein Purification, 2nd Edition. Methods in Enzymology 463. pp. 131–147. ISBN 9780123745361. PMID 19892171. doi:10.1016/S0076-6879(09)63011-1. 
  10. ↑ Ortega, Claudia; Prieto, Daniel; Abreu, Cecilia; Oppezzo, Pablo Javier; Correa, Agustin (2018). "Multi-compartment and multi-host vector suite for recombinant protein expression and purification.". Frontiers in Microbiology (en English) 9: 1384. ISSN 1664-302X. PMC 6030378. PMID 29997597. doi:10.3389/fmicb.2018.01384. 
  11. ↑ 11,0 11,1 Brown, Terry (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: an Introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 978-1-4051-1121-8. 
  12. ↑ Ye, X.; Al-Babili, S.; Klöti, A.; Zhang, J.; Lucca, P.; Beyer, P.; Potrykus, I. (2000). "Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm". Science 287 (5451): 303–305. Bibcode:2000Sci...287..303Y. PMID 10634784. doi:10.1126/science.287.5451.303. 
  13. ↑ Koller, B. H.; Smithies, O. (1992). "Altering Genes in Animals by Gene Targeting". Annual Review of Immunology 10: 705–730. PMID 1591000. doi:10.1146/annurev.iy.10.040192.003421. 
  14. ↑ Lear, J. (1978). Recombinant DNA: The Untold Story. New York: Crown Publishers. p. 43.
  15. ↑ 15,0 15,1 Jackson, D.; Symons, R.; Berg, P. (1972). "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 69 (10): 2904–2909. Bibcode:1972PNAS...69.2904J. PMC 389671. PMID 4342968. doi:10.1073/pnas.69.10.2904. 
  16. ↑ Mertz, J. E.; Davis, R. W. (1972). "Cleavage of DNA by R 1 restriction endonuclease generates cohesive ends". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 69 (11): 3370–4. Bibcode:1972PNAS...69.3370M. PMC 389773. PMID 4343968. doi:10.1073/pnas.69.11.3370. 
  17. ↑ Lobban, P.; Kaiser, A. (1973). "Enzymatic end-to end joining of DNA molecules". Journal of Molecular Biology 78 (3): 453–471. PMID 4754844. doi:10.1016/0022-2836(73)90468-3. 
  18. ↑ Cohen, S.; Chang, A.; Boyer, H.; Helling, R. (1973). "Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70 (11): 3240–3244. Bibcode:1973PNAS...70.3240C. PMC 427208. PMID 4594039. doi:10.1073/pnas.70.11.3240. 
  19. ↑ Hughes, S. (2001). "Making dollars out of DNA. The first major patent in biotechnology and the commercialization of molecular biology, 1974-1980" (PDF). Isis; an International Review Devoted to the History of Science and Its Cultural Influences 92 (3): 541–575. PMID 11810894. doi:10.1086/385281. hdl:10161/8125. 
  20. ↑ Johnson, I. S. (1983). "Human insulin from recombinant DNA technology". Science 219 (4585): 632–637. Bibcode:1983Sci...219..632J. PMID 6337396. doi:10.1126/science.6337396. 
  21. ↑ Wang, Xing; Hunter, Alan K.; Mozier, Ned M. (2009-06-15). "Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment". Biotechnology and Bioengineering (en inglés) 103 (3): 446–458. ISSN 0006-3592. PMID 19388135. doi:10.1002/bit.22304. 
  22. ↑ Bracewell, Daniel G.; Francis, Richard; Smales, C. Mark (2015-07-14). "The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control". Biotechnology and Bioengineering (en inglés) 112 (9): 1727–1737. ISSN 0006-3592. PMC 4973824. PMID 25998019. doi:10.1002/bit.25628. 

Véxase tamén

Outros artigos

Bibliografía

Ligazóns externas

Traído desde «https://gl.wikipedia.org/w/index.php?title=ADN_recombinante&oldid=5577128»