Diferenciación celular

En bioloxía do desenvolvemento, a diferenciación celular é o proceso polo cal unha célula menos especializada se converte noutro tipo celular máis especializado. A diferenciación ocorre numerosas veces durante o desenvolvemento dun organismo pluricelular, xa que o organismo cambia desde un simple cigoto inicial a un sistema complexo de distintos tecidos e moitos tipos celulares, e a diferenciación continúa na vida adulta porque as células nais do adulto se dividen e orixinan células fillas completamente diferenciadas durante a reparación dos tecidos ou a renovación normal das células. A diferenciación pode cambiar drasticamente o tamaño dunha célula, a súa forma, potencial de membrana, actividade metabólica, e capacidade de resposta a sinais. Estes cambios débense en grande medida a modificacións na expresión xénica que están moi controladas. Con poucas excepcións, a diferenciaciónn celular case nunca implica un cambio nas secuencias de ADN da célula. Deste modo, diferentes células poden adquirir características físicas e capacidades moi distintas a pesar de que todas teñen o mesmo xenoma.

A capacidade de diferenciación dunha célula en tipos distitos varía dependendo da clase de célula, e as de maior capacidade son as chamadas totipotentes e pluripotentes. Unha célula que pode diferenciarse en todos os tipos celulares dun organismo adulto denomínase pluripotente. Ditas células denomínanse células nais embrionarias nos animais e células meristemáticas nas plantas superiores. Unha célula que pode diferenciarse en todo tipo de células, incluíndo as do tecido placentario, denomínase totipotente. Nos mamíferos só o cigoto e os primeiros blastómeros formados a partir del son totipotentes, mentres que nas plantas moitas células diferenciadas poden facerse totipotentes utilizando técnicas simples de laboratorio. En citopatoloxía, o nivel de diferenciación celular utilízase como unha medida da progresión do cancro. O grao dun tumor é un marcador da diferenciación que presenta unha célula tumoral.

Tipos de células de mamíferos e desenvolvemento

No corpo dun mamífero podemos encontrar tres tipos básicos de células: células xerminais, células somáticas, e células nais (ou troncais). Todas e cada unha das aproximadamente 10¹⁴ células que hai nun humano adulto teñen a súa propia copia ou copias do xenoma agás certos tipos celulares, como os glóbulos vermellos, que carecen de núcleo no seu estado completamente diferenciado (téñeno inicialmente). A maioría das células son diploides, e teñen dúas copias de cada cromosoma. Tales células, chamadas células somáticas, constitúen a maior parte do corpo humano e diferenciáronse para especializarse en diferentes funcións.

As células da liña xerminal son as que orixinan os gametos (ovocitos e espermatozoides) e pasan o seu xenoma ás seguintes xeracións. As células nais, pola súa parte, teñen a capacidade de dividirse por períodos de tempo indefinidos e dan lugar a células especializadas e a outras células fillas que se manteñen como células nais.

O cigoto ten a potencialidade de orixinar un organismo enteiro. Nas primeiras horas despois da formación do cigoto, este divídese formando células idénticas. Nos humanos, catro días despois e tras varios ciclos de divisións, as células empezan a especializarse, formando unha esfera oca de células chamada blastociste. O blastociste ten unha capa externa de células, e no interior da súa esfera oca, hai un grupo de células chamado masa de células interna, as cales formarán virtualmente todos os tipos de tecidos do corpo humano, pero non poderían formar un organismo enteiro, polo que son pluripotentes.

As células nais pluripotentes seguen especializándose en células proxenitoras multipotentes, que dan lugar ás células funcionais do corpo. Entre estas células están as células nais hematopoiéticas (células nais adultas), as células nais mesenquimais (adultas), as células nais epiteliais (células proxenitoras) ou as células satélite musculares (proxenitoras), entre outras.

A partir da blástula embrionaria dunha soa capa orixiínanse as tres capas embrionarias primarias de mamíferos, que son o ectoderma, mesoderma e endoderma. O ectoderma orixinará a pel e o sistema nervioso, o mesoderma os ósos e o tecido muscular, e o endoderma forma os tecidos dos órganos internos.

Desdiferenciación

Micrografía dun liposarcoma con certa diferenciación, que non é identificable como liposarcoma (beira esquerda da imaxe), e un compoñente diferenciado con lipoblastos e incremento da vascularización (á dereita na imaxe). O tecido adiposo completamente diferenciado, morfoloxicamente benigno (no centro da imaxe) ten poucos vasos sanguíneos. Tinguidura de hematoxilina-eosina.

A desdiferenciación é un proceso celular que se dá en formas de vida basais, como en vermes e anfibios nos cales un célula diferenciada parcial ou terminalmente volve a un estado de desenvolvemento previo máis indiferenciado, o que xeralmente forma parte dun proceso rexenerativo. A desdiferenciación tamén ocorre en plantas. As células en cultivo celular poden perder as propiedades que orixinalmente tiñan, como a expresión de certas proteínas, ou cambian de forma. Este proceso tamén se denomina desdiferenciación.

Algúns investigadores opinan que a dsdiferenciación é unproceso aberrante do ciclo de desenvolvemento normal, que pode orixinar un cancro, pero outros cren que é unha parte natural da resposta inmune que perderon os humanos nalgún momento pasado como resultado da súa evolución.

Descubriuse unha pequena molécula chamada reversina, que é un análogo de purina, que induce a desdiferenciación dos miotubos. Estas células desdiferenciadas poden despois rediferenciarse en osteoblastos e adipocitos.

Métodos de desdiferenciación

Hai varios métodos para reverter as células somáticas adultas ao estado de pluripotencia ou totipotencia. No caso da totipotencia, a reprogramación está mediada por un ovocito en metafase II maduro como na transferencia nuclear de célula somática (Wilmut et al., 1997). Traballos recentes demostraron a fraxilidade dos cigotos enucleados ou de blastómeros temperáns detidos quimicamente durante a mitose, nos que se produce rotura da envoltura nuclear, para soportar a reprogramación á totipotencia nun proceso chamado transferencia cromosómica (Egli e Eggan, 2010).

Os métodos de reprogramación directa úsanse na reversión á pluripotencia; aínda que os vehículos e biotipos varían considerablemente en eficacia (Takahashi e Yamanaka, 2006). A transdución mediada por virus é eficaz na desdiferenciación á pluripotencia por medio de rutas retrovirais ou de ADN viral pero leva aparellado o problema da inactivación insercional. Adicionalmente, demostrouse a reprogramación epixenética pola expresión reforzada de OSKM por medio de rutas de ADN como ADN de plásmido, minicírculos, transposóns, episomas e constructos de ADN multicistrónico dirixidos por recombinación homóloga; porén, estes métodos poden provocar alteracións potenciais no xenoma receptor pola inserción de xenes (Ho et al., 2010). Aínda que a transdución mediada por proteínas serve para a reprogramación de células adultas a pluripotentes, o método é incómodo e require a expresión dunha proteína recombinante e unha purificación coidadosa, e reprograma con moi baixas frecuencias (Kim et al., 2009). Un problema importante de usar ARN para reprogramar células é a súa fraxilidade e que os biotipos de ARN monocatenario activan as vías da defensa innata antiviral como os interferóns e as vías dependentes de NF-κB. O ARN transcrito in vitro, con modificacións estabilizantes como unha carapucha 5' de 5-metilguanosina ou ribonucleobases substituídas, por exemplo o pseudouracilo, é 35 veces máis eficaz que a transdución viral e ten o beneficio adicional de non alterar o xenoma somático (Warren et al., 2010).

Mecanismos

Mecanismos da diferenciación celular.

Cada tipo celular especializado dun organismo expresa un subconxunto de todos os xenes do seu xenoma. Cada tipo celular defínese polo seu patrón particular de regulación da expresión xénica. A diferenciación celular é así unha transición da célula dun tipo a outro e implica un cambio desde un patrón de expresión xénica a outro. A diferenciación celular durante o desenvolvemento pode entenderse como o resultado dunha rede regulatoria de xenes. Un xene regulador e os seus módulos cis-regulatorios son nodos nesta rede regulatoria de xenes, que reciben sinais de entrada (input) e xeran sinais de saída (output) noutras partes da rede. O enfoque que fai a bioloxía de sistemas á bioloxía do desenvolvemento subliña a importancia de investigar o modo en que interaccionan os mecanismos de desenvolvemento para producir patróns predicibles (morfoxénese). Porén, propúxose recentemente unha visión alternativa, que está baseada na expresión xénica estocástica, na que a diferenciación celular é o resultado dun proceso de presión selectiva darwiniana que ocorre entre as células. Neste marco, as redes de xenes e proteínas son o resultado de procesos celulares e non a súa causa. Ver: darwinismo celular.

Xeralmente os procesos celulares conservados evolutivamente implicados nos mecanismos celulares que controlan estes cambios son só duns poucos tipos. Os principais tipos de procesos celulares que controlan a diferenciación celular son a sinalización celular. Moitas das moléculas sinalizadoras que transmiten información de célula a célula durante o control da diferenciaciónn celular denomínanse factores de crecemento. Aínda que os detalles das vías de transdución de sinais específicas varían, estas vías a miúdo comparten as seguintes etapas xerais. Un ligando producido por unha célula únese a un receptor no lado extracelular doutra célula, inducindo un cambio conformacional no receptor. A forma do dominio citoplasmático do receptor cambia, e o receptor adquire unha actividade encimática. O receptor despois cataliza reaccións que fosforilan outras proteínas, activándoas. Unha fervenza de reaccións de fosforilación activa finalmente un factor de transcrición dormente ou proteína citoesquelética, contribuíndo así ao proceso de diferenciación na célula diana. As células e os tecidos poden variar en competencia, é dicir, na súa capacidade de responderen a sinais externos.

A indución de sinais refírese ás fervenzas de eventos de sinalización, durante os cales a célula ou os sinais dos tecidos se envían a outra célula ou tecido para influenciar o seu desenvolvemento. Yamamoto e Jeffery investigaron o papel da lente na formación dos ollos dos peixes que habitan en covas e na superficie, que é un exemplo claro de indución. Por medio de transplantes recíprocos, Yamamoto e Jeffery atoparon que a vesícula da lente dos peixes de superficie pode inducir o desenvolvemento doutras partes do ollo tanto nos peixes moradores de covas coma de superficie, mentres que a vesícula da lente dos peixes de covas non pode facelo.

Outro importante mecanismo entra dentro da categoría das divisións celulares asimétricas, divisións que dan lugar a células fillas con destinos de desenvolvemento distintos. As divisións celulares asimétricas poden ocorrer a causa de determinantes citoplasmáticos maternos expresados asimetricamente ou debido a sinalización. No primeiro destes mecanismos, créanse células fillas distintas durante a citocinese debido a unha distribución desigual de moléculas reguladoras na célula parental; o citoplasma diferente que herda cada célula filla dá lugar a un patrón distinto de diferenciación en cada célula filla. Un exemplo ben estudado de formación de patrón por división celular asimétrica é o patrón do eixe corporal de Drosophila. As moléculas de ARN son un importante tipo de sinal de control intracelular da diferenciación. A base xenética e molecular das divisións celulares asimétricas tamén se estudou nas algas verdes do xénero Volvox, un sistema modelo para estudar como os organismos unicelulares poden evolucionar a organismos pluricelulares. Na especie Volvox carteri, as 16 células do hemisferio anterior dun embrión de 32 células divídense asimetricamente, producindo cada unha unha célula filla grande e outra pequena. O tamaño da célula ao final de todas as divisións celulares determina se esta se converterá nunha célula xerminal especializada ou nunha célula somática.

Control epixenético da diferenciación celular

Como cada célula dun organismo, independentemente do tipo que sexa, ten o mesmo xenoma, a determinación do tipo celular debe ocorrer no nivel da expresión dos xenes. Aínda que a regulación da expresión xénica pode ocorrer por medio de elementos cis- ou trans-regulatorios como son os promotores e amplificadores (enhancers) dos xenes, xorde o problema de como se mantén este patrón de expresión ao longo de numerosas xeracións de división celular. Os procesos epixenéticos xogan un papel fundamental na regulación da decisión de destinar a unha célula a ser unha célula nai, proxenitora ou madura diferenciada. Este capítulo centrarase principalmente nas células nais de mamíferos.

Importancia do control epixenético

Lister R. et. al. nunha publicación de 2011 avaliaron a extensión e complexidade do papel dos procesos epixenéticos na determinación da diferenciación que vai sufrir unha célula mediante a programación epixenómica aberrante de células nais pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). Como as células nais pluripotentes inducidas se cre que imitan as células nais embrionarias (ESC) nas súas propiedades pluripotentes, deberían existir poucas diferenzas epixenéticas entre elas. Para comprobaren esta predición, os autores realizaron o perfil de xenoma completo dos patróns de metilación do ADN en varias células nais embrionarias humanas, en iPSC, e en liñas de células proxenitoras.

No experimeto de Lister et al. reprogramáronse células adiposas femininas, do pulmón fibroblastos, e fibroblastos do prepucio a un estado pluripotente inducido cos xenes OCT4, SOX2, KLF4, e MYC. Comparáronse os patróns de metilación do ADN en ESCs, iPSCs, e células somáticas, e observáronse semellanzas significativas nos niveis de metilación entre células pluripotentes inducidas e embrionarias. Arredor do 80% dos dinucleótidos CG nas ESCs e iPSCs estaban metilados, e igualmente o estaban só o 60% dos dinucleótidos CG nas células somáticas. Ademais, as células somáticas posúían mínimos niveis de metilación de citosinas fóra dos dinucleótidos CG, mentres que as células pluripotentes inducidas posuían niveis similares de metilación que as células embrionais, entre o 0,5 e o 1,5%. Así, en correspondencia coas súas respectivas actividades transcricionais, os patróns de metilación do ADN, polo menos a nivel xenómico, son similares en ESCs e en iPSCs.

Porén, ao examinaren máis detidamente os patróns de metilación, descubriron que había 1175 rexións de metilación diferencial en dinucleótidos CG entre polo menos unha liña celular iPs ou ES. Comparando estas rexións de metilación diferencial con rexións de metilación de citosina nas células somáticas orixinais, o 44-49% das rexións metiladas diferencialmente mostraban patróns de metilación das respectivas células somáticas proxenitoras, mentres que o 51-56% destas rexións eran difeentes tanto das liñas celulares embrionais coma proxenitoras. A diferenciación inducida in vitro de liñas iPSC presentou transmisión do 88% e 46% de rexións hiper e hipometiladas diferencialmente, respectivamente.

Poden tirarse dúas conclusións deste estudo. A primeira, que o proceso epixenético está moi implicado na determinación da diferenciación das células, como indican os niveis similares de metilación de citosina entre as células pluripotentes inducidas e as células nais embrionais, que concorda cos seus respectivos patróns de transcrición. Segundo, os mecanismos de desdiferenciación (e por extensión, diferenciación) son moi complexos e non poden ser duplicados facilmente, como indica o número significativo de rexións metiladas diferencialmente entre as liñas celulares iPS e as ES.

Algúns dos mecanismos epixenéticos que se cre que regulan a diferenciación celular explícanse a continuación.

Mecanismos de regulación epixenética

Factores pioneiros (Oct4, Sox2, Nanog)

Tres factores pioneiros de transcrición, OCT4, SOX2, e NANOG, o primeiro dos cales utilizado na reprogramación iPSC, exprésanse fortemente en células nais embrionais indeferenciadas e son necesarios para o mantemento da súa pluripotencia. Crese que o fan por medio de alteracións da estrutura da cromatina, como a modificación de histonas e a metilación do ADN, para restrinxir ou permitir a transcrición dos xenes diana.

Polycomb repressive complex (PRC2)

In the realm of gene silencing, Polycomb repressive complex 2, one of two classes of the Polycomb group (PcG) family of proteins, catalyzes the di- and tri-methylation of histone H3 lysine 27 (H3K27me2/me3). By binding to the H3K27me2/3-tagged nucleosome, PRC1 (also a complex of PcG family proteins) catalyzes the mono-ubiquitinylation of histone H2A at lysine 119 (H2AK119Ub1), blocking RNA polymerase II activity and resulting in transcriptional suppression. PcG knockout ES cells do not differentiate efficiently into the three germ layers, and deletion of the PRC1 and PRC2 genes leads to increased expression of lineage-affiliated genes and unscheduled differentiation. Presumably, PcG complexes are responsible for transcriptionally repressing differentiation and development-promoting genes.

Trithorax group proteins (TrxG)

Alternately, upon receiving differentiation signals, PcG proteins are recruited to promoters of pluripotency transcription factors. PcG-deficient ES cells can begin differentiation but cannot maintain the differentiated phenotype. Simultaneously, differentiation and development-promoting genes are activated by Trithorax group (TrxG) chromatin regulators and lose their repression. TrxG proteins are recruited at regions of high transcriptional activity, where they catalyze the trimethylation of histone H3 lysine 4 (H3K4me3) and promote gene activation through histone acetylation. PcG and TrxG complexes engage in direct competition and are thought to be functionally antagonistic, creating at differentiation and development-promoting loci what is termed a “bivalent domain” and rendering these genes sensitive to rapid induction or repression.

Metilación do ADN

A regulación da expresión xénica conséguese ademais por medio de metilación do ADN, na cal a metilación mediada por ADN metiltransferase de residuos de citosina en dinucleótidos CpG mantén a represión heredable ao controlar a accesibilidade de ADN. A maioría de sitios CpG en células nais embrionais non están metiladas e parecen estar asociados con nucleosomas que levan H3K4me3. Despois da diferenciación, un pequeno número de xenes, como o OCT4 e o NANOG, están metilados e os seus promotores reprimidos para impedir a súa futura expresión. As células nais embrionais con metilación deficiente entran rapidamente en apoptose despois da súa diferenciación in vitro.

Posicionamento de nucleosomas

Aínda que a secuencia de ADN de case todas as células dun organismo é a mesma, os patróns de unión dos factores de transcrición e os patróns correspondentes de expresión xénica son diferentes. En grande medida, as diferenzas na unión de factores de transcrición están determinados pola accesibilidade á cromatina dos seus sitios de unión por medio de modificación de histonas e/ou factores pioneiros. En particular, é importante saber se un nucleosoma está cubrindo un sitio de unión xenómico ou non. Estudos recentes dilucidaron o papel do posicionamento de nucleosomas durante o desenvolvemento de células nais.

Role of signaling in epigenetic control

A final question to ask concerns the role of cell signaling in influencing the epigenetic processes governing differentiation. Such a role should exist, as it would be reasonable to think that extrinsic signaling can lead to epigenetic remodeling, just as it can lead to changes in gene expression through the activation or repression of different transcription factors. Interestingly, little direct data is available concerning the specific signals that influence the epigenome, and the majority of current knowledge consist of speculations on plausible candidate regulators of epigenetic remodeling. We will first discuss several major candidates thought to be involved in the induction and maintenance of both embryonic stem cells and their differentiated progeny, and then turn to one example of specific signaling pathways in which more direct evidence exists for its role in epigenetic change.

The first major candidate is Wnt signaling pathway. The Wnt pathway is involved in all stages of differentiation, and the ligand Wnt3a can substitute for the overexpression of c-Myc in the generation of induced pluripotent stem cells. On the other hand, disruption of ß-catenin, a component of the Wnt signaling pathway, leads to decreased proliferation of neural progenitors.

Growth factors comprise the second major set of candidates of epigenetic regulators of cellular differentiation. These morphogens are crucial for development, and include bone morphogenetic proteins, transforming growth factors (TGFs), and fibroblast growth factors (FGFs). TGFs and FGFs have been shown to sustain expression of OCT4, SOX2, and NANOG by downstream signaling to Smad proteins. Depletion of growth factors promotes the differentiation of ESCs, while genes with bivalent chromatin can become either more restrictive or permissive in their transcription.

Several other signaling pathways are also considered to be primary candidates. Cytokine leukemia inhibitory factors are associated with the maintenance of mouse ESCs in an undifferentiated state. This is achieved through its activation of the Jak-STAT3 pathway, which has been shown to be necessary and sufficient towards maintaining mouse ESC pluripotency. Retinoic acid can induce differentiation of human and mouse ESCs, and Notch signaling is involved in the proliferation and self-renewal of stem cells. Finally, Sonic hedgehog, in addition to its role as a morphogen, promotes embryonic stem cell differentiation and the self-renewal of somatic stem cells.

The problem, of course, is that the candidacy of these signaling pathways was inferred primarily on the basis of their role in development and cellular differentiation. While epigenetic regulation is necessary for driving cellular differentiation, they are certainly not sufficient for this process. Direct modulation of gene expression through modification of transcription factors plays a key role that must be distinguished from heritable epigenetic changes that can persist even in the absence of the original environmental signals. Only a few examples of signaling pathways leading to epigenetic changes that alter cell fate currently exist, and we will focus on one of them.

Expression of Shh (Sonic hedgehog) upregulates the production of Bmi1, a component of the PcG complex that recognizes H3K27me3. This occurs in a Gli-dependent manner, as Gli1 and Gli2 are downstream effectors of the Hedgehog signaling pathway. In culture, Bmi1 mediates the Hedgehog pathway’s ability to promote human mammary stem cell self-renewal. In both humans and mice, researchers showed Bmi1 to be highly expressed in proliferating immature cerebellar granule cell precursors. When Bmi1 was knocked out in mice, impaired cerebellar development resulted, leading to significant reductions in postnatal brain mass along with abnormalities in motor control and behavior. A separate study showed a significant decrease in neural stem cell proliferation along with increased astrocyte proliferation in Bmi null mice.

In summary, the role of signaling in the epigenetic control of cell fate in mammals is largely unknown, but distinct examples exist that indicate the likely existence of further such mechanisms.