Ensaio encimático

Espectrómetro Beckman DU640 UV/Vis

Os ensaios encimáticos son métodos de laboratorio usados para medir a actividade encimática. Son esenciais para o estudo da cinética encimática e a inhibición encimática.

Unidades de encima

A cantidade ou concentración dun encima pode expresarse en cantidades molares, igual que con outros compostos químicos, ou en termos de actividade en unidades de encima.

Actividade encimática

A actividade dun encima é unha medida da cantidade de encima activo presente e é así dependente de varias condicións físicas, as cales deberían especificarse.

Calcúlase usando a seguinte fórmula:

$\mathrm {a} =\mathrm {n} _{\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V}$

onde

$\mathrm {a}$ = Actividade encimática

$\mathrm {n} _{\text{t}}$ = Moles de substrato convertidos por unidade de tempo

$\mathrm {r}$ = Velocidade da reacción

$\mathrm {V}$ = Volume de reacción

A unidade do SI utilizada é o katal (kat), 1 katal = 1 mol s⁻¹ (mol por segundo), pero esta é unha unidade excesivamente grande. Un valor máis práctico e usado é o medido en unidades de encima (U) = 1 μmol min⁻¹ (micromol por minuto). 1 U corresponde a 16,67 nanokatals.

A actividade encimática dada en katals xeralmente se refire á do substrato diana considerado natural do encima. A actividade encimática pode tamén darse como a que presenta con certos substratos estándar, como a xelatina, medida entón en unidades de dixestión de xelatina (GDU polas súas siglas en inglés), ou proteínas do leite, medida entón en unidades de coagulación do leite (MCU polas súas siglas en inglés). As unidades GDU e MCU están baseadas na rapidez con que un gramo do encima dixire a xelatina ou as protínas do leite, respectivamente. 1 GDU é igual aproximadamente a 1,5 MCU.

O aumento da cantidade de substrato incrementa a velocidade da reacción encimática; porén, unha vez pasado certo punto, a velocidade da reacción xa non varía porque a cantidade de sitios activos dispoñibles no encima permanece constante.

Actividade específica

A actividade específica dun encima é outra medida común. É a actividade dun encima por miligramo de proteína total (expresado en μmol min⁻¹ mg⁻¹). A actividade específica dá lugar a unha medida da pureza do encima na mestura. Son os micromoles de produto formados por un encima nun determinado lapso de tempo (minutos) nas condicións dadas por miligramo de proteínas totais. A actividade específica é igual á velocidade de reacción multiplicada polo volume de reacción dividido pola masa de proteína total. A unidade do SI é o katal/kg, pero unha unidade máis práctica é μmol/(mg*min).

A actividade específica é unha medida da procesividade do encima (a capacidade do encima de procesar), a unha concentración de substrato específica (xeralmente saturante), e adoita ser constante para un encima puro.

Pode realizarse un proceso de titulación dun sitio activo eliminando os erros que se orixinan polas diferenzas no cultivo de lotes e/ou o pregamento incorrecto do encima e outros asuntos similares. Esta é unha medida da cantidade de encima activo, calculada por, por exemplo, titulación da cantidade de sitios activos presentes empregando un inhibidor irreversible. A actividade específica debería entón expresarse como μmol min⁻¹ mg⁻¹ de encima activo. Se coñecemos o peso molecular do encima, o némero de recambio ou de turnover, ou μmol de produto por segundo por μmol de encima activo, pode calcularse a partir da actividade específica. O número de recambio pode visualizarse como o número de veces que cada molécula de encima leva a cabo o seu ciclo catalítico por segundo.

Terminoloxía relacionada

A velocidade dunha reacción é a concentración de substrato que desaparece (ou de produto producido) por unidade de tempo (mol L⁻¹ s⁻¹).

A % de pureza é 100 % × (actividade específica da mostra de encima / actividade específica de encima puro). A mostra impura ten unha menor actividade específica porque parte da masa non é en realidade encima. Se coñecemos a actividade específica dun encima puro ao 100 %, entón unha mostra impura terá unha menor actividade específica, o que permite calcular a pureza e despois obter un resultado claro.

Tipos de ensaios

Todos os ensaios de encimas miden o seu consumo de substrato ou a súa produción de produto co paso do tempo. Existen un gran número de métodos de medida das concentracións de substratos e produtos e moitos encimas poden ensaiarse de varias maneiras. Os bioquímicos adoitan estudar as reaccións catalizadas por encimas usando catro tipos de experimentos:

• Experimentos de velocidade inicial. Cando se mestura un encima cun grande exceso de substrato, acumúlase o intermediario encima-substrato nunha rápida transición. Despois a reacción atinxe unha cinética de estado estable na cal os intermediarios encima-substrato permanecen aproximadamente constante co tempo e a velocidade da reacción cambia de forma relativamente lenta. As velocidades mídense durante un curto período de tempo despois de alcanzar o estado case estable, normalmente monitorizando a acumulación do produto co tempo. Como as medidas se realizan durante un curto período de tempo e debido ao grande exceso de substrato, pode facerse a aproximación de que a cantidade de substrato libre é aproximadamente igual á cantidade de substrato inicial. O experimento de velocidade inicial é o experimento máis simple de realizar e analizar, estando relativamente libre de complicacións como reaccións revertidas (back-reaction) e a degradación do encima. É, por tanto, con diferenza o tipo de experimento máis utilizado en cinética encimática.
• Experimentos de curva de progreso. Nestes experimentos, os parámetros cinéticos están determinados a partir de expresións das concentracións de especies en función do tempo. A concentración dos substratos ou produtos é rexistrada no tempo despois da rápida transición inicial e por un período o suficientemente longo para permitir que a reacción se aproxime ao equilibrio. Os experimenos de curva de progreso foron moi usados na etapa inicial da cinética encimática, pero son menos comúns agora.
• Experimentos de cinética transitoria. Nestes experimentos, rastréase o comportamento da reacción durante a transición rápida inicial a medida que o intermediario chega ao período de cinética de estado estable. Estes experimentos son máis difíciles de realizar que os dous mencionados antes porque require técnicas especializadas (como a fotólise flash de compostos engaiolados) ou a mestura rápida (como o fluxo interrompido, fluxo atemperado ou fluxo continuo).
• Experimentos de relaxación. Nestes experimentos, pertúrbase unha mestura en equilibrio de encima, substrato e produto, por exemplo por un salto de temperatura, de presión ou de pH, e monitorízase o retorno ao equilibrio. A análise destes experimentos debe considerar a reacción reversible total. Ademais, os experimentos de relaxación son relativamente insensibles a detalles da mecánica e non son normalmente usados para a identificación do mecanismo, aínda que poden utilizarse para iso baixo as condicións apropiadas.

Os ensaio de encimas poden dividirse en dous grupos de acordo co seu método de mostraxe: ensaios continuos, nos que o ensaio dá unha lectura continua da actividade, e ensaios descontinuos, no que se toman as mostras, a reacción detense e despois determínase a concentración de substratos/produtos.

Portador de cubeta nun espectrómetro controlado pola temperatura.

Ensaios continuos

Os ensaios continuos son os máis convenientes, xa que o ensaio dá a velocidade da racción sen que sexa necesario ningún traballo adicional. Hai moitos tipos de ensaios continuos.

Espectrofotométrico

En ensaios espectrofotométricos, seguen o curso da reacción medindo un cambio na cantidade de luz que absorbe a solución do ensaio. Se esta luz está na rexión visible pode verse un cambio de cor no ensaio, e estes ensaios denomínanse ensaios colorimétricos. O ensaio MTT, un ensaio redox no que se usa unha tinguidura tetrazolio como substrato é un exemplo de ensaio colorimétrico.

Con frecuencia úsase luz UV, xa que os coencimas comúns NADH e NADPH absorben luz UV nas súas formas reducidas, pero non nas súas formas oxidadas. Unha oxidorredutase que usa NADH como substrato pode, por tanto, ensaiarse seguindo o decrecemento na absorbancia UV á lonxitude de onda de 340 nm, a medida que se consome o coencima.

Ensaios directos e ensaios acoplados

Ensaio acoplado para a hexoquinase usando glicosa-6-fosfato deshidroxenase.

Incluso cando a reacción encimática non causa un cambio na absorbancia de luz, aínda é posible usar un ensaio espectrofotométrico para o encima utilizando un ensaio acoplado. Nestes ensaios, o produto dunha reacción utilízase como substrato doutra reacción facilmente detectable. Por exemplo, a figura 1 mostra o ensaio acoplado para o encima hexoquinase, que se pode facer acoplando a súa produción de glicosa 6-fosfato á produción de NADPH, empregando o encima glicosa-6-fosfato deshidroxenase.

Fluorométrico

A fluorescencia prodúcese cando unha molécula emite luz dunha lonxitude de onda despois de absorber luz doutra lonxitude de onda diferente. Os ensaios fluorimétricos usan unha diferenza na fluorescencia do substrato respecto do produto para medir a reacción encimática. Estes ensaios son en xeral moito máis sensibles que os ensaios espectrofotométricos, pero poden ter interferencias causadas por impurezas e a inestabilidade de moitos compostos fluorescentes cando se expoñen á luz.

Un exemplo destes ensaios é outra vez o uso de coencimas nucleótidos como o NADH e NADPH. As súas formas reducidas son fluorescentes e as oxidadas non. As reaccións de oxidación poden, por tanto, ir seguidas por unha diminución na fluorescencia, e as reaccións de redución por un incremento. Tamén se dispón de substratos sintéticos que liberan unha tinguidura fluorescente nunha reacción catalizada por un encima, como o 4-metilumbeliferil-β-D-galactósido para ensaiar a β-galactosidase ou o 4-metilumbeliferil-butirato para ensaiar a lipase de Candida rugosa.

Calorimétrico

Quimioluminescencia do luminol.

A calorimetría nos ensaios encimáticos é a medida da calor liberada ou absorbida polas reaccións químicas. Estes ensaios son moi xerais, xa que moitas reaccións implican algún cambio na calor e co uso dun microcalorímetro non cómpre utilizar moito encima ou substrato. Estes ensaios poden usarse para medir reaccións que son imposibles de ensaiar de ningún outro xeito.

Quimioluminescente

A quimioluminescencia é a emisión de luz por unha reacción química. Algunhas reaccións encimáticas producen luz e isto pode medirse para detectar a formación de produto. Estes tipos de ensaio poden ser extremadamente sensibles, xa que a luz producida pode ser capturada por unha película fotográfica durante días ou semanas, pero pode ser difícil de cuantificar porque non se vai poder detectar toda a luz liberada pola reacción.

A detección da peroxidase do ravo picante por quimioluminescencia encimática é un método común de detección de anticorpos nos western blotting. Outro exemplo é o encima luciferase, que se encontra en vagalumes e produce de forma natural luz a partir do seu substrato luciferina.

Dispersión da luz

A dispersión da luz estática mide o produto da masa molar ponderada e a concenración de macromoléculas en solución. Dada unha concentración total fixada dunha ou máis especies no tempo de medida, o sinal de dispersión é unha medida directa da masa molar ponderada da solución, que varía a medida que os complexos se forman ou disocian. Polo tanto, as medidas cuantifican a estequiometría dos complexos así como a súa cinética. Os enasios de dispersión de luz da cinética de proteínas son unha técnica moi xeral que non require un encima.

Termoforese a microescala

A termoforese a microescala (MST polas súas siglas en inglés) mide o tamaño, carga e entropía de hidratación de moléculas/substratos no equilibrio. O movemento termoforético dun substrato etiquetado fluorescentemente cambia significativamente a medida que é modificado por un encima. Esta actividade encimática pode medirse cun tempo de resolución alto en tempo real. O consumo de material de todos os métodos ópticos de termoforese a microescala é moi baixo, só se necesitan 5 μL de volume de mostra e unha concentración 10nM de encima para medir as constantes de velocidade encimática para a actividade e a inhibición. A termoforese a microescala permite medir a modificación de dous substratos diferentes á vez (multiplexación) se ambos os substratos están etiquetados con diferentes fluoróforos. Así, poden realizarse experimentos de competición de substratos.

Ensaios descontinuos

Os ensaios descontinuos son aqueles nos que as mostras dunha reacción encimática se toman a intervalos e mídese a cantidade de produción de produto ou consumo de substrato nestas mostras.

Radiométricos

Os ensaios radiométricos miden a incorporación de radioactividade en substratos ou a súa liberación dos substratos. Os isótopos radioactivos que se usan máis frecuentemente nestes ensaios son o ¹⁴C, o ³²P, o ³⁵S e o ¹²⁵I. Como os isótopos radioactivos permiten facer un etiquetado específico dun só átomo ou un substrato, estes ensaios son ambos extremadamente sensibles e específicos. Utilízanse frecuentemente en bioquímica e a miúdo son a única maneira de medir unha reacción específica en extractos crus (as complexas mesturas de encimas producidas cando se lisan células).

A radioactividade adoita medirse nestes procedementos usando un contador de escintilos.

Cromatográfico

Os ensaios cromatográficos miden a formación de produto separando a mestura de reacción nos seus compoñentes por cromatografía. Isto faise normalmente por cromatografía líquida de alto rendemento (HPLC polas súas siglas en inglés), pero pode tamén usarse a técnica máis simple da cromatografía en capa fina. Aínda que esta estratexia pode necesitar gran cantidade de material, a súa sensibilidade pode incrementarse etiquetando os substratos/produtos cun marcador radioactivo ou fluorescente. A sensibilidade do ensaio tamén se incrementou cambiando os protocolos a instrumentos cromatográficos mellorados (por exemplo, cromatografía líquida de ultraalta presión) que funciona a presión de bomba varias veces maior que os instrumentos de HPLC (ver Cromatografía líquida de alto rendemento#Bomba de presión).

Factores que afectan os ensaios

Unha cámara de presión para medir a actividade encimáica a alta presión.

Varios factores afectan o resultado dos ensaios e unha revisión recente resume os diversos parámetros que se deben monitorizar para realizar correctamente un ensaio.

Concentración de sales

A maioría dos encimas non poden tolerar concentración de sales extremadamente altas. Os ións interfiren cos enlaces iónicos febles das proteínas. Os encimas típicos son activos a concentacións salinas de 1-500 mM. Como é habitual, hai excepcións como nas algas halófilas e bacterias halófilas.

Efectos da temperatura

Todos os encimas funcionan nun intervalo de temperatura específico para o organismo. Os aumentos de temperatura xeralmente producen un inremeno da velocidade de reacción. Hai un límite para este incremento, porque as temperaturas máis altas levan a un brusco descenso da velocidade da reacción debido á desnaturalización (alteración) da estrutura da proteína causada pola rotura de enlaces débiles iónicos e de hidróxeno que estabilizaban a estrutura tridimensional do sitio activo do encima. A temperatura "óptima" para encimas humanos adoita estar entre os 35 e os 40 °C. A temperatura media do corpo humano é 37 °C. Os encimas humanos empezan a desnaturalizarse rapidamente a temperaturas por riba dos 40 °C. Os encimas das arqueas termófilas atopadas nas fontes termais son estables ata os 100 °C. Porén, a idea dunha velocidade "óptima" dunha reacción encimática leva a confusión, xa que a velocidade observada a calquera tempertura é o produto de dúas velocidades, a velocidade de reacción e a velocidae de desnatualización. Se se vai usar un ensaio que mida a actividade durante un segundo, dará unha actividade alta a altas temperaturas, pero se se vai usar un ensaio que mida a formación de produto durante unha hora, dará unha actividade baixa a esas temperaturas.

Efectos do pH

A maioría dos encimas son sensibles ao pH e teñen intervalos específicos de actividade. Todos teñen un pH óptimo. O pH pode parar a actividae encimática ao desnaturalizar a forma tridimensional do encima ao romper enlaces iónicos e de hidróxeno. A maioría dos encimas funcionan entre pH 6 e 8; pero a pepsina no estómago funciona mellor a pH 2 e a tripsina a pH 8.

Saturación de encima

Incrementar a concentración de substrato incrementa a velocidade da reacción (actividade encimática). Porén, a saturación do encima limita a velocidade da reacción. Un encima está saturado cando o sitio activo de todas as moléculas está ocupado a maior parte do tempo. No punto de saturación, a reacción xa non acelera máis, non importa canto substrato máis se adicione. A gráfica da velocidade de reacción chega a unha meseta.

Nivel de ateigamento

O feito de haber unha gran cantidade de macromoléculas nunha solución (está ateigada) altera a velocidade da reacción e a constante de equilibrio das reaccións encimáticas, por un efecto chamado ateigamento macromolecular.

Lista de ensaios encimáticos

• Ensaio MTT (metil tiazol tetrazolio)
• Hidrólise de diacetato de fluoresceína
• para-Nitrofenilfosfato

Véxase tamén

Outros artigos

• Encima de restrición
• Ensaio de pegada de DNase
• Cinética encimática

Ligazóns externas

• "Assays Protocols - OpenWetWare". OpenWetWare. BioBricks Foundation. Consultado o 2022-07-27.